Анализ компетентности переносчиков комаров Aedes aegypti с использованием вируса Зика
Summary
Представленный протокол может определить векторную компетентность популяций комаров Aedes aegypti для данного вируса, такого как Зика, в условиях сдерживания.
Abstract
Представленные процедуры описывают обобщенную методологию заражения комаров Aedes aegypti вирусом Зика в лабораторных условиях для определения скорости инфицирования, диссеминированной инфекции и потенциальной передачи вируса в рассматриваемой популяции комаров. Эти процедуры широко используются с различными изменениями в оценках векторной компетентности во всем мире. Они важны для определения потенциальной роли, которую данный комар (т.е. вид, популяция, особь) может играть в передаче данного агента.
Introduction
Векторная компетентность определяется как способность на уровне вида, популяции и даже особи данного членистоногого, такого как комар, клещ или флеботоминовая песчаная муха, приобретать и передавать агент биологически с репликацией или развитием у членистоногих1,2. Что касается комаров и переносимых членистоногими вирусов (т.е. арбовирусов), то агент всасывается из виремированного хозяина самкой комара. После приема внутрь вирус должен продуктивно заразить одну из небольшой популяции эпителиальных клеток средней кишки3,преодолевая различные физиологические препятствия, такие как протеолитическая деградация пищеварительными ферментами, наличие микробиоты (барьер инфекции средней кишки, или MIB) и секретируемый перитрофический матрикс. Инфекция эпителия средней кишки должна сопровождаться репликацией вируса и возможным побегом из средней кишки в открытую кровеносную систему комара, или гемолимфу, которая представляет собой начало диссеминированной инфекции, преодолевающей барьер побега средней кишки (MEB). В этот момент вирус может установить инфекции вторичных тканей (например, нервов, мышц и жировых тел) и продолжать размножаться, хотя такая вторичная репликация может быть не строго необходима вирусу для заражения ацинарных клеток слюнных желез (преодоление инфекционного барьера слюнных желез). Выход из ацинарных клеток слюнной железы в их апикальные полости, а затем движение в слюнный проток позволяет инокуляцию вируса последующим хозяевам при укусе и завершает цикл передачи1,2,4,5,6,7.
Учитывая этот хорошо охарактеризованный и в целом законсервированный механизм распространения внутри комара-переносчика, лабораторные оценки компетентности переносчиков часто методологически схожи, хотя различия в протоколах существуют1,2. Как правило, после перорального воздействия вируса комары рассекаются таким образом, что отдельные ткани, такие как полная кишка, ноги, яичники или слюнные железы, могут быть проанализированы на вирусную инфекцию, диссеминированную инфекцию, диссеминированную инфекцию / потенциальную трансовариальную передачу и диссеминированную инфекцию / потенциальную способность передачи, соответственно8. Однако само присутствие вируса в слюнных железах не является окончательным доказательством способности к передаче, учитывая доказательства барьера выхода/выхода слюнной железы (SGEB) в некоторых комбинациях вектор/вирус1,2,4,5,7,9. Стандартным методом доказывания компетентности к передаче остается передача комарами восприимчивому животному10,11,12. Однако, учитывая, что для многих арбовирусов это требует использования иммунокомпрометированных мышиных моделей13,14,15,16,этот метод часто является непомерно дорогостоящим. Широко используемой альтернативой является сбор слюны комара, который может быть проанализирован с помощью обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) или инфекционного анализа, чтобы продемонстрировать наличие вирусного генома или инфекционных частиц соответственно. Стоит отметить, что такие методы сбора слюны in vitro могут переоценивать12 или недооценивать17 количество вируса, депонированного во время кормления in vivo, что указывает на то, что такие данные следует интерпретировать с осторожностью. Тем не менее, метод in vitro очень ценен при анализе с точки зрения простого присутствия вируса в слюне, что указывает на потенциал передачи.
Существуют два основных подхода к определению роли комаров-переносчиков в вспышках арбовирусных заболеваний. Первый метод предполагает полевой эпиднадзор, при котором комары собираются в контексте активной передачи18,19,20,21,22,23,24. Однако, учитывая, что уровень инфицирования, как правило, довольно низок (например, по оценкам, уровень инфицирования комаров в 0,061% в районах активной циркуляции вируса Зика (ZIKV) в Соединенных Штатах21),инкриминирование потенциальных видов переносчиков может быть сильно смещено методологией отлова25,26 и случайностью (например, отбор проб одного инфицированного человека из 1 600 неинфицированных)21 . Принимая это во внимание, данное исследование может не приобрести достаточно комаров как в сыром количестве, так и в видовом разнообразии, чтобы точно отобрать комаров, участвующих в передаче. Напротив, анализ векторной компетентности проводится в лабораторных условиях, что позволяет строго контролировать такие параметры, как пероральная доза. Несмотря на то, что эти лабораторные оценки не в полной мере способны представить истинную сложность инфекции комаров и возможности ее передачи в полевых условиях, они остаются мощными инструментами в области арбовирусологии.
Основываясь на различных анализах векторной компетентности с помощью ZIKV у нескольких видов комаров, популяций и методов27,28,29,30,31,32,а также недавнего обзора оценок компетентности переносчиков1,мы описываем здесь несколько протоколов, связанных с типичным рабочим процессом векторной компетентности. В этих экспериментах три популяции Ae. aegypti из Северной и Южной Америки (город Сальвадор, Бразилия; Доминиканская Республика; и нижняя часть долины Рио-Гранде, штат Техас, США) подвергались воздействию одного штамма ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) при дозе 4, 5 или 6 log10 фокусообразующих единиц (FFU) / мл с помощью искусственных кровяных мук. Впоследствии они были проанализированы на наличие инфекции, диссеминированной инфекции и компетентности передачи после различных периодов внешней инкубации (2, 4, 7, 10 и 14 дней) с помощью рассечения и инфекционного анализа на основе клеточной культуры. Хотя нынешний рабочий процесс/протоколы оптимизированы для ZIKV, многие элементы непосредственно переводятся в другие переносимые комарами арбовирусы в содержании членистоногих и уровнях биобезопасности 2 и 3 (ACL/BSL2 или ACL/BSL3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы, описанные здесь, обеспечивают обобщенный рабочий процесс для проведения векторного анализа компетенций. В качестве общей основы многие из этих методологий сохраняются во всей литературе. Тем не менее, есть существенные возможности для модификаций (рассмотренных в Azar and Weaver<sup cl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы выражаем признательность сотрудникам Всемирного референс-центра по новым вирусам и арбовирусам (WRCEVA): д-ру Роберту Тешу, Хильде Гусман, д-ру Кеннету Планте, д-ру Джессике Планте, Дионне Шартон и Дивье Мирчандани, за их неустанную работу по курированию и предоставлению многих вирусных штаммов, используемых для экспериментов по векторной компетентности наших и других групп. Представленная работа финансировалась Фондом стипендий Маклафлина (SRA) и грантами NIH AI120942 и AI121452.
Materials
| 3mL Standard Reservoir | R37P30 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| 7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls | 4RJH9 | Grainger | Grinding Media |
| Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case | A16-P4 | FisherScientific | Fixative |
| Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture | A6419-1G | MilliporeSigma | Reagent |
| Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 | MAB10216 | MilliporeSigma | Primary Antibody for focus forming assay |
| Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle | 5450-0011 | KPL/Seracare | Secondary Antibody for focus forming assay |
| Bleach | NC0427256 | FisherScientific | Decontamination |
| Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 | 10-126-34 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-740 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-91 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Crystal Violet | C0775-100G | MilliporeSigma | Stain |
| Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case | 05-402-7 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-70C | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-49A | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case | 13-675-20 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case | 13-675-15B | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case | 13-675-30 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case | 13-675-22 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | 08-772B | FisherScientific | Plastic consumable |
| Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL | S11150 | Atlanta Biologicals | Cell culture reagent |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | 12-550-A3 | FisherScientific | Immobilization of Mosquitos |
| FU1 Feeder | FU1-0 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; feeding units |
| Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles | 140-040-182 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle | 15-290-026 | Fisher Scientific | Cell culture reagent |
| Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case | 15-140-163 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles | 25-200-114 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles | 11-965-118 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit | 7203706 | Lampire | Bloodmeal preparation |
| InsectaVac Aspirator | 2809B | Bioquip | Insectary Equipment |
| Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case | A412-4 | FisherScientific | Fixative |
| Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle | M0512-250G | MilliporeSigma | Cell culture reagent |
| Micro-chem Plus Disinfectant Detergent | C849T34 | Thomas Scientific | Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium |
| Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology | M5904-5X5ML | MilliporeSigma | Immobilization of Mosquitos |
| O-rings | OR37-25 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| Plastic Plugs | PP5-250 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| PS6 Power Unit (110-120V) | PS6120 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; power source |
| Rubis Forceps, Offset blades, superfine points | 4525 | Bioquip | Insectary Equipment |
| Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case | 50-809-242 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Sucrose, BioUltra, for molecular biology | 84097-250G | MilliporeSigma | Reagent |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case | 21-402-487 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-486 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-484 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-482 | FisherScientific | Plastic consumable |
| TissueLyser II | 85300 | QIAGEN | Homogenization |
| TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL | 5510-0030 | Seracare | Developing solution for focus forming assay |
| Vero | CCL-81 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
| Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] | CRL-1586 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
Riferimenti
- Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867 (2019).
- Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
- Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
- Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
- Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
- Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
- Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, 453-458 (2016).
- Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).
- Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
- Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102 (2016).
- Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346 (2017).
- Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
- Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
- Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
- Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
- Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
- Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
- Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
- Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
- Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
- Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
- Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
- Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).
- Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
- Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
- Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462 (2019).
- Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661 (2018).
- Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
- Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072 (2019).
- Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
- Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434 (2018).
- Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
- Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
- Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).
- Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
- Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
- Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
- Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).
- Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
- Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).
