Простое обнаружение первичной силии с помощью иммунофлуоресценции
Summary
Первичные реснички являются внеклеточными структурами, связанными с центриолом. Первичное обнаружение ресничок с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания является относительно простой процедурой, которая приводит к чрезвычайно высококачественным изображениям. В этом протоколе фибробласты, выражаюющие первичные реснички, были зафиксированы, ослаблены иммунитетом и изображены в флуоресцентном или конфокальцаторном микроскопе.
Abstract
Первичные реснички динамически регулируются во время прогрессирования клеточного цикла, особенно во время фаз G0/G1 клеточного цикла, ресорбируются до митоза. Первичные реснички можно визуализировать с помощью очень сложных методов, включая электронную микроскопию передачи, 3D-изображение или программное обеспечение для автоматического обнаружения первичных ресничок. Тем не менее, иммунофлуоресцентное окрашивание первичных ресничок необходимо для выполнения этих методов. Эта публикация описывает протокол для легкого обнаружения первичных ресничок in vitro путем окрашивания ацетилированного альфа-тубулина (аксонема) и гамма-тубулина (базального тела). Этот иммунофлюоресцентный протокол окрашивания относительно прост и приводит к высококачественным изображениям. В настоящем протоколе описывается, как четыре клеточные линии (C2C12, MEF, NHLF и фибробласты кожи), выражают первичные реснички, были зафиксированы, ослаблены иммунитетом и изображены флуоресцентным или конфокальные микроскопы.
Introduction
Первичные реснички сенсорные, одиночные, мембранные, немотильные структуры, связанные с матери центриоля клетки. Первичные реснички находятся на большинстве позвоночных клеток, за исключением красных кровяных телец,адипоцитов 1, и гепатоцитов2. Первичные реснички образуются как удлиненный аксонем, состоящий из микротрубочек, основным компонентом которых является З-тубулин. Аксонем растет из базального тела, которое структурировано из З-тубулина. Длина первичных ресничок колеблется от 2 до 10 мкм; однако, его размеры могут меняться во время гликилирования, голодания, гипоксии, цитотоксического стресса, или после воздействия ионизирующего излучения3,,4,,5,,6,,7. Как правило, клетки имеют только один первичный цилий, который участвует в морфогенезе и клеточной сигнализации пути важны для пролиферацииклеток и дифференциации 8,9.
Первичные реснички динамически регулируются во время прогрессирования клеточного цикла, особенно во время фаз G0/G1, и ресорбируются перед входом в митоз в процессе, связанном с деацетилированием тубулина при посредничестве HDAC6 (гистон диацетилаза 6)10. Точный момент первичной ресорбции реций зависит от типа клетки и экспрессии генов, непосредственно участвующих в этом процессе, таких как Аврора A, Plk1, TcTex-111,12,13. В зависимости от типа клетки, первичные реснички выражают различные типы рецепторов, ионных каналов и активных сигнальных путей. К ним относятся наиболее важные сигнальные рецепторы, влияющие на пролиферацию и выживание, EGFR, PDGFR и FGFR. Также включены некоторые из сигнальных путей, которые могут повлиять на функцию одного или нескольких органов, в том числе Ежик, Нотч, и Wnt. Благодаря этим рецепторам и сигнальных путей, первичные реснички также выполнять химиосенсорную функцию. Эта функция позволяет первичным реснички обнаружить конкретные лиганды для Notch, гормоны, и биологически активных веществ, таких как серотонин или соматостатин. Другие специфические функции, выставленные первичными реснички разной длины включают реакцию на изменения температуры, гравитации и осмолальности14.
Первичные реснички могут быть визуализированы с помощью различных методов, таких как живая визуализация, электронная микроскопия передачи, 3D-изображение, или с помощью программногообеспечения для автоматического обнаружения первичных ресничок 5,15,16,17. Тем не менее, эти методы являются высокоспециализированными и текущих исследований потребностей основных, быстрых и простых методов для окрашивания первичных ресничок на каждом этапе исследований. Описанный является простым и полезным методом для обнаружения первичных ресничок в культурных клетках.
Protocol
Representative Results
Discussion
Некоторые авторы описали различные методы обнаружения первичных ресничок, иногда также описывая различные методы фиксации, которые могут повлиять на их обнаружение6,,20,,21,22. Несмотря на это, трудно найти полный и прос…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Министерством обороны Чешской Республики – Долгосрочный план развития организации Медицинские аспекты оружия массового уничтожения факультета военных медицинских наук, Университет обороны; Министерство образования, молодежи и спорта Чешской Республики (Специальный исследовательский проект No: СВ/ ФВЗ201703) и ПРОГРЕС No40/06. Спасибо также Даниэлю Диасу за его добрую помощь в пересмотре английского языка.
Materials
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
Riferimenti
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a “sleeping beauty” in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Sloboda, R. . Primary cilia. , (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
