Detecção Simples de Cília Primária por Imunofluorescência
Summary
Cílios primários são estruturas extracelulares associadas ao centriole. A detecção primária de cílios por coloração imunofluorescente é um procedimento relativamente simples que resulta em imagens de altíssima qualidade. Neste protocolo, os fibroblastos que expressavam cílios primários foram fixados, imunossuídos e imagedos em um microscópio fluorescente ou confocal.
Abstract
Os cílios primários são dinamicamente regulados durante a progressão do ciclo celular, especificamente durante as fases G0/G1 do ciclo celular, sendo resorcridas antes da mitose. Cilia primária pode ser visualizada com métodos altamente sofisticados, incluindo microscopia eletrônica de transmissão, imagem 3D, ou usando software para a detecção automática de cílios primários. No entanto, a coloração imunofluorescente da cília primária é necessária para realizar esses métodos. Esta publicação descreve um protocolo para a fácil detecção de cílios primários in vitro, detectando tubulina alfa acetilada (axoneme) e gamma tubulin (corpo basal). Este protocolo de coloração imunofluorescente é relativamente simples e resulta em imagens de alta qualidade. O presente protocolo descreve como quatro linhas celulares (C2C12, MEF, NHLF e fibroblastos de pele) expressando cílios primários foram fixas, imunos detidas e imagens com um microscópio fluorescente ou confocal.
Introduction
Os cílios primários são estruturas sensoriais, solitárias, ligadas à membrana, não-mastile associadas à centriola mãe da célula. Cilias primárias são encontradas na maioria das células vertebrados, com exceção de glóbulos vermelhos, adipócitos1e hepatócitos2. Cilia primária são formadas como um axoneme alongado composto por microtúbulos, cujo componente principal é α-tubulina. O axoneme cresce a partir do corpo basal, que é estruturado a partir de γ-tubulin. O comprimento da cília primária varia entre 2-10 μm; no entanto, suas dimensões podem mudar durante a glicação, fome, hipóxia, estresse citotóxico, ou após a exposição à radiação ionizante3,4,5,,6,7. Geralmente, as células possuem apenas um cílio primário, que está envolvido na morfogênese e vias de sinalização celular importantes para a proliferação celular e diferenciação8,,9.
Os cílios primários são dinamicamente regulados durante a progressão do ciclo celular, especificamente durante as fases G0/G1, e resordiram antes de entrar em mitose em um processo associado à deacetilação de tubulina mediada por HDAC6 (histone deacetylase 6)10. O momento exato da resorção de cílios primários depende do tipo celular e da expressão de genes diretamente envolvidos nesse processo, como Aurora A, Plk1, TcTex-11,11,12,13. Dependendo do tipo celular, os cílios primários expressam diferentes tipos de receptores, canais de íons e vias de sinalização ativa. Estes incluem os receptores de sinalização mais importantes que afetam a proliferação e a sobrevivência, EGFR, PDGFR e FGFR. Também estão incluídas algumas das vias de sinalização que podem afetar a função de um ou mais órgãos, incluindo Hedgehog, Notch e Wnt. Graças a esses receptores e vias de sinalização, os cílios primários também executam uma função de quimioensory. Esta função permite que a cília primária detecte ligantes específicos para Notch, hormônios e substâncias biologicamente ativas, como serotonina ou somatostatina. Outras funções específicas exibidas por cílios primários de diferentes comprimentos incluem reação a mudanças de temperatura, gravidade e osmolalidade14.
O cílio primário pode ser visualizado através de diversos métodos, como visualização ao vivo, microscopia eletrônica de transmissão, imagem 3D ou por software para a detecção automática de cílios primários5,,15,,16,,17. No entanto, esses métodos são altamente especializados e a pesquisa em andamento precisa de métodos básicos, rápidos e fáceis para coloração de cílios primários em todas as etapas da pesquisa. Descrito é um método fácil e útil para a detecção de cílios primários em células cultivadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vários autores descreveram diversos métodos para detecção de cílios primários, às vezes também descrevendo vários métodos de fixação que podem afetar sua detecção6,,20,,21,22. Independentemente disso, é difícil encontrar um protocolo completo e simples para detecção. A disponibilidade pronta de tal método seria, sem dúvida, de grande assistência ao estudo da investigação …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Defesa da República Tcheca – Plano de desenvolvimento de organizações de longo prazo Aspectos Médicos de Armas de Destruição Em Massa da Faculdade de Ciências da Saúde Militar da Universidade de Defesa; o Ministério da Educação, Juventude e Esporte, República Tcheca (Projeto de Pesquisa Específica Nº: SV/ FVZ201703) e PROGRES Q40/06. Obrigado também a Daniel Diaz por sua gentil assistência na revisão da língua inglesa.
Materials
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
Riferimenti
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