Simpel påvisning af primær cilier ved immunofluorescens
Summary
Primære cilier er ekstracellulære strukturer forbundet med centriole. Primær cilia detektion ved immunfluorescerende farvning er en forholdsvis enkel procedure, der resulterer i ekstremt høj kvalitet billeder. I denne protokol, fibroblaster udtrykke primære cilier blev fastsat, immunstained, og afbildet i en fluorescerende eller konfokal mikroskop.
Abstract
Primære cilier reguleres dynamisk under cellecyklusprogression, specielt i G0/G1-faserne af cellecyklussen, og som resorberes før mitose. Primær cilier kan visualiseres med meget avancerede metoder, herunder transmission elektron mikroskopi, 3D-billeddannelse, eller ved hjælp af software til automatisk påvisning af primære cilier. Men, immunfluorescerende farvning af primære cilier er nødvendig for at udføre disse metoder. Denne publikation beskriver en protokol til nem påvisning af primær cilier in vitro ved farvning acetylerede alpha tubulin (axoneme) og gamma tubulin (basal krop). Denne immunfluorescerende farvning protokol er relativt enkel og resulterer i billeder i høj kvalitet. Denne protokol beskriver, hvordan fire cellelinjer (C2C12, MEF, NHLF og hudfibroblaster), der udtrykker primær cilier, blev fikseret, immunstained og afbildet med et fluorescerende eller konfokal mikroskop.
Introduction
Primære cilier er sensoriske, ensomme, membran-bundet, ikke-tåtil strukturer forbundet med cellens mor centriole. Primære cilier findes på de fleste hvirveldyr celler med undtagelse af røde blodlegemer, adipocytter1, og hepatocytes2. Primær cilier dannes som en aflang axonme sammensat af mikrotubuli, hvis hovedkomponent er α-tubulin. Axonemet vokser fra den basale krop, som er struktureret fra γ-tubulin. Længden af den primære cilier varierer mellem 2-10 μm; dimensionerne kan dog ændre sig under glycylation, sult, hypoxi, cytotoksisk stress eller efter udsættelse for iioniserendestråling 3,4,,5,6,7. Normalt har celler kun ét primært cilium, som er involveret i morfogenese og cellesignalveje, der er vigtige for celleproliferedning og differentiering8,9.
Primære cilier reguleres dynamisk under cellecyklusprogression, specielt i G0/G1-faserne, og resorberes, før de indtastes i mitose i en proces forbundet med tubulindeacetylation medieret af HDAC6 (histone deacetylase 6)10. Det nøjagtige øjeblik for primær cilia resorption afhænger af celletype og udtryk for gener direkte involveret i denne proces, såsom Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. Afhængigt af celletypen udtrykker den primære cilier forskellige typer receptorer, ionkanaler og aktive signalveje. Disse omfatter de vigtigste signalreceptorer, der påvirker spredning og overlevelse, EGFR, PDGFR og FGFR. Også inkluderet er nogle af de signalveje, der kan påvirke funktionen af et eller flere organer, herunder pindsvin, Notch, og Wnt. Takket være disse receptorer og signalveje, den primære cilier også udføre en kemosensorisk funktion. Denne funktion gør det muligt for primære cilier at opdage specifikke ligander for Notch, hormoner, og biologisk aktive stoffer såsom serotonin eller somatostatin. Andre specifikke funktioner udstillet af primære cilier af forskellige længder omfatter reaktion på ændringer i temperatur, tyngdekraft, og osmolalitet14.
Primær cilier kan visualiseres ved hjælp af forskellige metoder, såsom levende visualisering, transmission elektron mikroskopi, 3D-billedbehandling, eller ved software til automatisk påvisning af primære cilier5,15,16,17. Men disse metoder er højt specialiserede og igangværende forskning behov grundlæggende, hurtig og nem metoder til farvning primære cilier i alle faser af forskningen. Beskrevet er en nem og nyttig metode til påvisning af primære cilier i dyrkede celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere forfattere har beskrevet forskellige metoder til påvisning af primære cilier, undertiden også beskriver forskellige fiksering metoder, der kan påvirke derespåvisning6,20,,21,22. Uanset hvad, er det svært at finde en komplet og ligetil protokol til registrering. Den disponibile metode vil uden tvivl være til stor hjælp for undersøgelsen af den primære cilierundersøgelse, især i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Forsvarsministeriet i Tjekkiet – Langsigtet organisation udviklingsplan Medicinske aspekter af masseødelæggelsesvåben af Fakultetet for MilitærSundhedsvidenskab, University of Defence; Ministeriet for Uddannelse, Ungdom og Sport, Tjekkiet (Specifikt forskningsprojekt Nr.: SV/ FVZ201703) og PROGRES Q40/06. Også tak til Daniel Diaz for hans venlige hjælp i engelsk revision.
Materials
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
Riferimenti
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a “sleeping beauty” in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Sloboda, R. . Primary cilia. , (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
