Eenvoudige detectie van primaire trilharen door immunofluorescentie
Summary
Primaire trilharen zijn extracellulaire structuren geassocieerd met de centriole. Primaire trilharendetectie door immunofluorescente kleuring is een relatief eenvoudige procedure die resulteert in beelden van zeer hoge kwaliteit. In dit protocol werden fibroblasten die primaire trilharen uitdrukken, vastgehouden, en afgebeeld in een fluorescerende of confocale microscoop.
Abstract
Primaire trilharen worden dynamisch gereguleerd tijdens de progressie van de celcyclus, met name tijdens de G0/G1-fasen van de celcyclus, die opnieuw worden bedhuisig vóór mitose. Primaire trilharen kunnen worden gevisualiseerd met zeer geavanceerde methoden, waaronder transmissie elektronenmicroscopie, 3D-beeldvorming, of met behulp van software voor de automatische detectie van primaire trilharen. Immunofluorescente kleuring van primaire trilharen is echter nodig om deze methoden uit te voeren. Deze publicatie beschrijft een protocol voor de eenvoudige detectie van primaire trilharen in vitro door het beitsen van geacetyleerde alfa tubuline (axoneme) en gamma tubuline (basaal lichaam). Dit immunofluorescente kleuringsprotocol is relatief eenvoudig en resulteert in beelden van hoge kwaliteit. Het huidige protocol beschrijft hoe vier cellijnen (C2C12, MEF, NHLF en huidfibroblasten) die primaire trilharen uitdrukken, werden vastgesteld, immunostained en afgebeeld met een fluorescerende of confocale microscoop.
Introduction
Primaire trilharen zijn zintuiglijke, solitaire, membraangebonden, niet-moge structuren geassocieerd met de moeder van de cel centriole. Primaire trilharen worden gevonden op de meeste gewervelde cellen, met uitzondering van rode bloedcellen, adipocyten1, en hepatocyten2. Primaire trilharen worden gevormd als een langwerpig axoneme samengesteld door microtubuli, waarvan de belangrijkste component α-tubuline is. De axoneme groeit uit het basale lichaam, dat is gestructureerd uit γ-tubuline. De lengte van de primaire trilharen varieert tussen 2-10 μm; de afmetingen kunnen echter veranderen tijdens glycyleratie, honger, hypoxie, cytotoxische stress of na blootstelling aan ioniserende straling3,4,5,6,7. Meestal hebben cellen slechts één primair cilium, dat betrokken is bij morfogenese en celsignaleringstrajecten die belangrijk zijn voor celproliferatie en differentiatie8,9.
Primaire trilharen worden dynamisch gereguleerd tijdens de progressie van de celcyclus, met name tijdens de G0/G1-fasen, en resorbed voordat ze mitose ingaan in een proces dat gepaard gaat met tubuline-deacetylatie bemiddeld door HDAC6 (histone deacetylase 6)10. Het exacte moment van primaire cilia resorptie is afhankelijk van het celtype en de expressie van genen die direct betrokken zijn bij dit proces, zoals Aurora A, Plk1, TcTex-11111,12,13. Afhankelijk van het celtype, de primaire trilharen uitdrukken verschillende soorten receptoren, ionkanalen, en actieve signalering trajecten. Deze omvatten de belangrijkste signaleringreceptoren die proliferatie en overleving beïnvloeden, EGFR, PDGFR en FGFR. Ook inbegrepen zijn enkele van de signalering trajecten die de functie van een of meer organen kunnen beïnvloeden, met inbegrip van Hedgehog, Notch, en Wnt. Dankzij deze receptoren en signalering trajecten, de primaire trilharen ook een chemosensorische functie uit te voeren. Deze functie maakt het mogelijk primaire trilharen om specifieke liganden voor Notch, hormonen, en biologisch actieve stoffen zoals serotonine of somatostatine detecteren. Andere specifieke functies tentoongesteld door primaire trilharen van verschillende lengtes zijn reactie op veranderingen in temperatuur, zwaartekracht en osmolaliteit14.
Primaire trilharen kunnen worden gevisualiseerd door middel van verschillende methoden, zoals live visualisatie, transmissie elektronenmicroscopie, 3D-beeldvorming, of door software voor de automatische detectie van primaire trilharen5,,15,,16,17. Echter, deze methoden zijn zeer gespecialiseerd en voortdurend onderzoek moet fundamentele, snelle en eenvoudige methoden voor het beitsen van primaire trilharen in elke fase van het onderzoek. Beschreven is een eenvoudige en nuttige methode voor de detectie van primaire trilharen in gekweekte cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende auteurs hebben diverse methoden beschreven voor de detectie van primaire trilharen, soms ook het beschrijven van verschillende fixatiemethoden die hun detectie kunnen beïnvloeden6,20,21,22. Hoe dan ook, het is moeilijk om een compleet en eenvoudig protocol voor detectie te vinden. De beschikbaarheid van een dergelijke methode zou ongetwijfeld van grote hulp zijn voor de studie va…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Defensie van de Tsjechische Republiek – Langetermijnorganisatie ontwikkelingsplan Medische aspecten van massavernietigingswapens van de faculteit Militaire Gezondheidswetenschappen, Universiteit van Defensie; het Ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport, Tsjechië (Specifiek Onderzoeksproject nr: SV/ FVZ201703) en PROGRES Q40/06. Dank ook aan Daniel Diaz voor zijn vriendelijke hulp in het Engels taalrevisie.
Materials
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
Riferimenti
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a “sleeping beauty” in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Sloboda, R. . Primary cilia. , (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
