Summary
Denne protokollen forsøker å etablere en repeterbar protokoll for primære nevroner og gliaisolasjon fra rotteblære for ytterligere cellulære eksperimenter.
Abstract
Den nedre urinveiene har to hovedfunksjoner, nemlig periodisk urinlagring og micturition; Disse funksjonene formidles gjennom sentral og perifer nevroregulering. Selv om det er forsket mye på nedre urinveisnervesystem, har de fleste studier fokusert på primærkultur. Denne protokollen introduserer en metode for isolasjon og kultur av blæren nevroner og glia fra Sprague-Dawley rotter. I denne metoden ble nevronene og glia inkubert i en 37 °C, 5 % CO2-inkubator i 5–7 dager. Som et resultat vokste de til modne former egnet for relaterte etterfølgende immunfluorescence eksperimenter. Celler ble morfologisk observert ved hjelp av et optisk mikroskop. Nevroner, synaptiske vesikler og glia ble identifisert av henholdsvis β-III-tubulin og MAP-2, Synapsin-1 og GFAP-farging. I mellomtiden ble immunocytokjemi utført på flere nevrotransmitterrelaterte proteiner, for eksempel kolin acetyltransferase, DYNLL2 og SLC17A9.
Introduction
Den nedre urinveiene har to hovedfunksjoner: periodisk urinlagring og micturition1. Det nedre urinveisnervesystemet (LUTNS) styrer disse funksjonene og er delikat og utsatt for mange nevropatier, som kan være medfødt (porfyri), ervervet (Lyme sykdom), sekundært til sykdomstilstander (diabetisk cystopati), indusert legemiddel (hemorragisk cystitis), kirurgi forårsaket (abdominoperineal reseksjon), eller skade forårsaket (traumatisk ryggmargsskade)2,3,4,5,6,7. I fysiologiske/patologiske studier er in vivo- og in vitro-eksperimenter like viktige. Mens in vivo forskning på LUTNS har blitt utført på organ-, cellulære og molekylære nivåer i noen tid, in vitro forskning på primære nevroner fra urinblæren er nesten ikke-eksisterende8,9. Selv om den nåværende studien er begrenset, håper vi å pionerforskningen på dette området slik at andre forskere kan forbedre den. På denne måten kan denne samkulturen føre til en cellulær forståelse av fysiologisk dysfunksjon i fenotyper, for eksempel blære nevron dysfunksjon.
I motsetning til enteriske muskler med en klar retning av muskelcellene i diskrete lag, er blærens muskler uorganiserte10. Derfor, i stedet for å skrelle av blærens ytre lag, foreslår denne metoden å fordøye hele blæren for å redusere vanskeligheten med drift og forkorte forbehandlingstiden for en høy celleoverlevelsesrate.
Etter denne metoden kan vi oppnå en blandet kultur av nevroner og andre celler. De andre cellene er uunnværlige fordi deres tilstedeværelse etterligner et in vivo-miljø11. I tillegg gir slike celler stoffene som ikke er tilgjengelige i mediet.
Denne metoden innebærer to trinn for fordøyelsen. For det første brukes kollagen type II til å hydrolysere kollagen, etterfulgt av trypsin, for å dissosiere vevet i celle10. På denne måten spres blærevev i enkeltceller og vokser deretter relativt uavhengig. Når kulturen av nevroner modnes, kan nevronene brukes til avbildning eller funksjonelle analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller og dyreprosedyrer fulgte de etiske prinsippretningslinjene i Det nasjonale forskningsrådet.
1. Fremstilling av materialer
- Steriliser alle instrumenter og ddH2O ved hjelp av en autoklav før du utfører eksperimentet. Instrumenter inkluderer, men er ikke begrenset til kirurgisk saks, oftalmisk saks, tang, skjeer kjernedeler, glassretter (60-100 mm i diameter) og glassbrytere.
- Klargjør Krebs-oppløsningen på følgende måte (Tabell 1): Løs opp alle kjemikaliene sammen med ddH2O før bruk. Løs opp CaCI2 separat og tilsett langsomt i den blandede oppløsningen under omrøring for å unngå sediment.
- Forbered skyllemediene, som består av F12-medier med 10% foster bovint serum (FBS) og 1% antibiotika / antimykotisk (100x). Tilsett 5 ml FBS og 0,5 ml antibiotika/antimykotisk til 44,5 ml F12-medier.
- Forbered nevronmedier A, som består av nevrobasale A-medier med 2% B-27, 1% FBS, 1% L-glutamin, 1% antibiotika / antimykotisk (100x) og 0,1% glia-avledet nevrotrofisk faktor (GDNF). Tilsett 200 μL B-27, 100 μL FBS, 100 μL L-glutamin, 100 μL antibiotika/antimykkotisk (100x) og 10 μL GDNF (10 μg/ml) til 9,5 ml nevrobasal A-medier.
MERK: Forbered nevronmedier A innen en uke etter bruk for å sikre friskhet av B-27, L-glutamin og GDNF. - Forbered neuron media B ved hjelp av samme prosedyre som utarbeidelsen av nevronmedier A, men uten å legge til FBS.
- Forbered fordøyelsesoppløsning 1 ved å oppløse 20 mg kollagenalus type II, 6 mg bovint serumalbumin og 200 μL antibiotika/antimykotika (100x) i 10 ml oksygenstabil Krebs-løsning.
- Forbered fordøyelsesoppløsning 2 ved å fortynne 1 ml 0,25% trypsin med 4 ml Hanks balanserte saltoppløsning.
- Forbered en tallerken med belagte deksler.
- Bruk tang i en laminær strømningsbenk når du plasserer glassdeksler i en 48-brønns kulturplate.
- Fortynn poly-D-lysin med ddH2O til en konsentrasjon på 0,1 mg/ml som poly-D-lysinbestand. Oppbevar lageret ved –20 °C, og tine før bruk.
- Tilsett 40 μL poly-D-lysin lager på toppen av hver dekslelip, og inkuber løsningen ved romtemperatur i 10 min.
MERK: For forskjellige plater med forskjellige basale områder, juster konsentrasjonen til 4 μg/cm2. For eksempel, hvis basalområdet på en brønn fra en 24-brønnsplate er 2 cm2, bør vi overføre 80 μL poly-D-lysin lager i en brønn. Hver cm2 ville inneholde 4 μg poly-D-lysin. - Fjern poly-D-lysin i 48-brønnsplaten, og skyll dekslene med ddH2O tre ganger.
- Tørk platen i en laminær strømningshette i minst 30 min for å sikre at platen er vannfri.
- Oppbevar platen ved 4 °C før lamininbelegg i maksimalt 1 dag. Oppbevaring av platen ved −20 °C er å foretrekke for langtidslagring.
- Tine laminin ved 4 °C. Fortynn laminin med ddH2O til en konsentrasjon på 50 μg/ml som lamininbestand. Oppbevar lageret ved –20 °C, og tine ved 4 °C før bruk.
- Bruk en pipette til å overføre 100 μL fortynnet laminin til toppen av hver dekslelip og inkubere laminin ved 4 °C i 1 time.
MERK: For forskjellige plater med forskjellige basale områder, juster konsentrasjonen til 5 μg/cm2. For eksempel, hvis basalområdet til en brønn fra en 24-brønns plate er 2 cm2, overfør deretter 200 μL fortynnet laminin i en brønn. Hver cm2 vil inneholde 5 μg laminin. - Fjern lamininoppløsningen, og skyll dekslene med ddH2O en gang. Utfør denne operasjonen på kanten av dekslene for å unngå skraping.
MERK: Belagte deksler kan oppbevares ved 4 °C i maksimalt 2 uker.
2. Blærehøst
- Få fem uker gamle Sprague-Dawley rotter.
- Tilsett karbogen (95 % oksygen, 5 % CO2) i Krebs-oppløsningen i minst 30 minutter i et isbad for å nå et stabilt oksygenstatus- og pH-nivå.
- Etter eutanasi via cervical dislokasjon, suge rotter i 75% etanol i 30 s for sterilisering.
- Plasser rotter på et sterilisert kirurgisk håndkle og eksponer magen. Åpne bukhulen, og avslør blæren med et sett saks og tang.
- Løft blæren forsiktig og kutt blæren fra blærehalsen med et annet sett saks og tang for å unngå krysskontaminering. Plasser blæren raskt i kald oksygenstabil Krebs-løsning for å forbedre celleoverlevelsen.
MERK: Når blæren er fjernet, utfør følgende operasjoner raskt for å forbedre utsiktene til nevronoverlevelse. - Tilsett Krebs løsning i tre glassretter og glassbrytere.
- Forbered glassretter og glassbrytere med Krebs-oppløsning i et isbad for forkjøling.
- Merk disse beholderne med tallene 1–3 tilsvarende for å forhindre forvirring.
- Par hver glassfat med tang og en skjekjernedeler.
- I glassfat 1, kutt opp blæren med oftalmisk saks, og brett den ut med tang og en skjekjernedeler.
- Skyll blæren i glassbryter 1, og legg den i glassfat 2.
- Eliminer tilhengerfett på vevsoverflaten ved hjelp av tang og oftalmisk saks i glassfat 2.
- Skyll blæren i glassbryter 2, og legg den i glassfat 3.
- Skrap blæren forsiktig ved hjelp av tang og skjeenes kjernedeler på glassfat 3 for å fjerne eksogene vedlegg.
- Skyll blæren i glassbryter 3, overfør blæren til et 15 ml sentrifugerør med 14 ml kald Krebs-løsning, og spinn prøven i 1 min ved 356 x g og 4 °C.
- Gjenta det forrige trinnet to ganger i to andre rør med Krebs-løsning for å redusere forurensning.
3. To-trinns blære fordøyelse
- Overfør blæren fra sentrifugerøret til et 2 ml hetteglass som inneholder 1 ml fordøyelsesoppløsning 1. Bruk oftalmisk saks for å kutte blæren i små biter (mindre enn 1 mm) i oppløsning.
- Bland blæreoppløsningen med 9 ml fordøyelsesoppløsning 1 i en steril cellekulturfat (100 mm i diameter). Utfør trinn 1 fordøyelse i en ristende inkubator i 1 time under 5% CO2,37 °C og 200 o/min.
- Etter trinn 1 fordøyelse, sentrifuger løsningen ved 356 x g ved 4 °C i 8 minutter.
- Plasser fordøyelsesoppløsningen 2 i et 37 °C vannbad for forvarming.
- Etter sentrifugering, fjern supernatanten som inneholder fordøyelsesoppløsning 1, og høst cellesedimentet. Noe gjenværende væske er tillatt. Fullstendig fjerning av løsningen kan fremme celletap.
- Bland cellesediment med varm fordøyelsesoppløsning 2 i et 15 ml sentrifugerør, og rist blandingen mens du fordøyer i et 37 °C vannbad i 5 minutter. Ikke overskrid 7 min av trinn 2 fordøyelsen eller nevroner vil gå til grunne.
- Etter fordøyelsen, deaktiver umiddelbart trypsin i blandingen med 10 ml kaldt skyllemedie.
MERK: Utfør følgende trinn ved 0 °C–4 °C. Et isbad kan gi en slik tilstand. - Høst cellesedimentet etter sentrifugering ved 356 x g ved 4 °C i 8 minutter. Fjern så mye medier som mulig fordi de resterende trypsin er skadelig for cellevekst.
- Resuspend sediment med 3 ml neuronmedier forsiktig. Sørg for at luftbobler ikke genereres i løsningen som inneholder celler for høy overlevelsesrate.
- Filtrer blandingsmediet gjennom en 70 μm cellesil i et 50 ml sentrifugerør.
- Hold filtratet på en shaker ved 30 o/min i et isbad i 30 minutter. Dette trinnet er ikke nødvendig, men anbefales.
- Samle celler ved sentrifugering ved 356 x g ved 4 °C i 8 minutter, og resuspender cellepellets forsiktig i 1 ml nevronmedie A.
- Tilsett 500 μL celleblanding i hver brønn av den tilberedte 48-brønnsplaten.
- Kulturceller i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Erstatt alle medier med neuron media B i 1 time for å gi en serumfri kultur.
- Bytt halvparten av nevronmediene B hver tredje dag.
MERK: Nevroner er klare for immunocytokjemiske eksperimenter etter 5-7 dager med kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I prosessen med primærcellekultur var cellene som ble anskaffet runde med lyse og klare grenser før den vedlagte tilstanden. Etter hvert som nevronene vokste, begynte dendritter og axoner å være distinkte. Etter 5-7 dager med kultur nådde nevronene en moden form med lange fremskrivninger, som var ideelle for avbildning eller funksjonsstudier. Selv om de fleste urenheter og cellerester kunne fjernes på grunn av skiftende medier, var visse rester festet til poly-D-lysin- og lamininbelegg synlige (figur 1).
Etter riktig kultur kan nevroner identifiseres via typisk β-III-tubulin og MAP-2 immunostaining10,12. I tillegg ble glia spesielt identifisert via GFAP immunstaining10. Eldre nevroner utviklet synaptiske spines, som var nær presynaptiske spesialiseringer identifisert ved immunstaining av synaptisk protein maker, synapsin-1 (Figur 2)12. Disse resultatene indikerte at modne celler med velutviklede synapser ble oppnådd gjennom denne metoden. Dette resultatet antyder sin viktige rolle i fremtidige funksjonsstudier.
I mellomtiden ble flere neuron-undertyper anerkjent gjennom immunocytokjemieksperimenter (figur 3). Peptidergiske nevroner, som inneholder ulike nevropeptider, ble immunostert med substans P13. Purinergiske nevroner med uttrykte vesikulære nukleotidtransportører ble identifisert via SLC17A9 farging14. Nitrergiske nevroner ble visualisert med DYNLL-2, som forbinder nNOS med motorproteiner i nevroner15. Kolinerge nevroner var immunoreaktive med kolin acetyltransferase16.
Figur 1. Fasekontrastbilder av primærceller isolert fra rotteblærekulturen tatt ved henholdsvis 1, 3 og 7 dager etter plating (henholdsvis A, B, C). Skala bar: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Immunfluorescence bilder av primære celler isolert fra rotteblæren. Konfokal mikroskopianalyse viste nevron cytoskjelett proteinfarging (β-III-tubulin, RRID: AB_2827688, 1:200) i primærkultur nevroner (A) og i hele montering blærepreparatet (B). I primærkulturen neuroner ble nevronal fosfoproteinimmunostaining (MAP 2, RRID:AB_2827689, 1:200) også visualisert (C). Glia ble identifisert via glial fibrillary sur protein farging (D; RRID: AB_627673, 1:50). Synapsiner ble visualisert via synapsinproteinfarging (Synapsin-1, RRID: AB_2798146, 1:200) i cellulære (E) og vev (F) nivåer. De sekundære antistoffene som ble brukt var som følger: Alexa Fluor 488 (grønn, geit anti-kanin lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (rød, geit anti-mus lgG, 1:200). Kjernen ble visualisert ved hjelp av Hoechst 33342 (A, C, D, E; blå, 1 μg/ml). Skala bar: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Immunfluorescence bilder av flere neuron subtyper av primære nevroner. Peptidergiske nevroner ble immunostert med substans P (A; RRID: AB_785913, 1:50). Purinergiske nevroner ble identifisert via SLC17A9 farging (B; RRID: AB_10597575, 1:200). Nitrergiske nevroner ble visualisert via DYNLL-2 farging (C; RRID: AB_654147, 1:50). Kolinerge nevroner var immunoreaktive med kolin acetylktransferase (D; RRID: AB_2244867, 1:100). De sekundære antistoffene som ble brukt var som følger: Alexa Fluor 488 (grønn, geit anti-kanin lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (rød, geit anti-mus lgG, 1:200). Kjernen ble visualisert ved hjelp av Hoechst 33342 (A, B, C, D, blå, 1 μg /ml). Skala bar: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Ingredienser | Molarity (mM) |
| NaCI | 120 |
| KCI | 5.9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| Glukose | 11.5 |
Tabell 1. Krebs løsningssammensetning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plate forberedelse
Bruk av glassdeksler i 6-, 12- eller 48-brønns kulturplater for immunfluoreserende eller kalsiumavbildningseksperimenter er en økonomisk og prøvesparende operasjon. Celler vokser godt i plater uten deksler under utarbeidelsen av primærcellekulturer. Derfor er deksler dispenserbare i eksperimenter, for eksempel vestlig blotter eller polymerasekjedereaksjon. Videre er belegg et nødvendig skritt før plating celler, med eller uten deksler. Laminin og poly-D-lysin er vanlige valg i belegg nevroner, spesielt laminin, som er avgjørende for nevronvekst17.
Forberedelse av medier
Etter første middels erstatning krever celleisolasjon medier uten serum fordi serum stimulerer celledeling og fører til et begrenset nevrondyrkende rom18. Dermed er nevron vekstfaktorer avgjørende. Kvaliteten på B27 og GDNF kan variere i stor grad fra forskjellige partier og forårsake store effekter på nevronvekst19. Derfor anbefales det å sjekke partinummeret til mediet når nevronutbyttet er dårlig. I mellomtiden er fersk mediebeholdning avgjørende; det nødvendige beløpet skal beregnes og klargjøres på forhånd hver gang før media byttes ut.
Dyr
Sprague-Dawley rotter brukes i denne metoden. C57BL/6 mus er også akseptable i dette eksperimentet. Derfor kan andre stammer av rotter eller mus også vedtas for denne metoden til tross for noen få variasjoner i morfologi og nevronalkretser. Når det gjelder ulike dyremodeller, bør forskere utvikle en optimalisert og målrettet protokoll. Videre bør unge dyr alltid vurderes før anvendelsen av denne metoden.
Vev behandling
Under forsøkene, bortsett fra fordøyelsesprosessen, er det viktig å holde vev ved lav temperatur for å øke celle levedyktigheten, noe som kan redusere cellemetabolismen og unngå energiunderskudd. Oksygennivåer, ernæring og pH kan også påvirke celleutbyttet11. Videre, for andre vev, foreslår vi at forskere utfører denne metoden med justert fordøyelsestilstand.
Cellekultur
En bemerkelsesverdig egenskap ved nevroner når de er inokulert, er deres raske overholdelse av belagte plater20. I dette tilfellet anbefales det å bytte media etter 1 h kultur for å få en høy andel nevroner. Videre, når de fleste cellene begynner å vokse pseudopodium, kan frekvensen av skiftende medier reduseres på riktig måte avhengig av fargen på mediet og cellulær tilstand. Primær cellekultur i god tilstand viser svart soma med en lys kantlinje.
De fleste nerveceller isolert fra blæren er blære intramural ganglia, som består av afferent og autonome sprudlende indre av blæren13. Videre er ingen store bekken ganglia til stede i høstet vev. Den fordeler seg under blærehalsen21.
Begrensning
Dette er en foreløpig forskning for å isolere og kultur nevroner og glia. Mange forsøk hadde blitt gjort, som cytarabinbehandling eller tetthet gradient sentrifugering. Imidlertid var andelen av ønskede celler fortsatt ikke ideell, og enda mer celletap dukket opp. Videre vil tradisjonelle fordøyelsesforhold i denne protokollen, for eksempel 37 °C, sannsynligvis drepe noen sensitive nevrontyper og forårsake potensielle genuttrykksartefakter22.
Til slutt tilbyr denne protokollen en metode for å dyrke nevroner og glia fra rotteblære. Isolasjonen er enkel å gjenta, tidseffektiv og innebærer minimal mikrobiell forurensning. Selv om forbedring som fremkaller renheten av nevroner er nødvendig, håper vi denne metoden bidrar til LUTNS-forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen stor interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant no. 81673676) og Dongguan Science and Technology Bureau (Grant no. 2019622101002). Forfatterne takker Dr. Maryrose Sullivan (universitetslektor i kirurgi, Harvard Medical School) for teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Golbidi, S., Laher, I.
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, Pt 9 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants - A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G.
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
