समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए एस्चेरिचिया कोलाई में जैविक शोर का निरंतर माप
Summary
यह काम एक माइक्रोस्कोपी विधि प्रस्तुत करता है जो सिंथेटिक जीन सर्किट के स्टोचस्टिक व्यवहार के विश्लेषण और मात्राकरण के लिए एस्चेरिचिया कोलाई की एक कोशिका की लाइव इमेजिंग की अनुमति देता है।
Abstract
यहां विकसित प्रोटोकॉल कई घंटों में एस्चेरिचिया कोलाई डिवीजन और फ्लोरोसेंट स्तर के कंप्यूटर ट्रैकिंग को सक्षम करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। यह प्रक्रिया उन कॉलोनियों के लिए स्क्रीनिंग से शुरू होती है जो न्यूनतम मीडिया पर जीवित रहते हैं, यह मानते हुए कि केवल एस्चेरिचिया कोलाई सही प्लाज्मिड को शरण देने वाले विशिष्ट परिस्थितियों में कामयाब हो सकेंगे। चूंकि बड़े आनुवंशिक सर्किट के निर्माण की प्रक्रिया, कई डीएनए भागों की असेंबली की आवश्यकता होती है, चुनौतीपूर्ण है, सर्किट घटकों को अक्सर कई एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग की आवश्यकता होती है विभिन्न कॉपी नंबरों पर कई प्लाज्मिड के बीच वितरित किए जाते हैं। प्लाज्मिड में उत्परिवर्तन एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के प्रतिलेखन को नष्ट कर सकते हैं और परिगलन के लिए अग्रणी कोशिका में संसाधन प्रबंधन के साथ interject । चयनित कॉलोनी एक ग्लास-बॉटम पेट्री डिश पर सेट की गई है और कुछ फोकस विमानों को उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट दोनों डोमेन में माइक्रोस्कोपी ट्रैकिंग के लिए चुना जाता है। प्रोटोकॉल प्रारंभिक परिस्थितियों के तहत 12 घंटे से अधिक के लिए छवि ध्यान रखता है जिसे विनियमित नहीं किया जा सकता है, जिससे कुछ कठिनाइयां पैदा होती हैं। उदाहरण के लिए, मृत कोशिकाएं इमेजिंग के कुछ घंटों के बाद लेंस के फोकस के क्षेत्र में जमा होने लगती हैं, जो विषाक्त पदार्थों को बिल्डअप और संकेत को धुंधला और क्षय करने का कारण बनती हैं। पोषक तत्वों की कमी नई मेटाबोलिक प्रक्रियाओं का परिचय देती है और सर्किट की वांछित प्रतिक्रिया में बाधा डालती है। प्रयोग का तापमान प्रेरकों और एंटीबायोटिक दवाओं की प्रभावता को कम करता है, जो संकेत की विश्वसनीयता को और नुकसान पहुंचा सकता है । न्यूनतम मीडिया जेल सिकुड़ता है और सूख जाता है, और परिणामस्वरूप ऑप्टिकल फोकस समय के साथ बदलता है। हमने एस्चेरिचिया कोलाईमें इन चुनौतियों से उबरने के लिए इस विधि को विकसित किया, जो अन्य सूक्ष्म जीवों के लिए अनुरूप तरीकों को विकसित करने वाले पिछले कार्यों के समान है। इसके अलावा, यह विधि अनछुए और परिवर्तित कोशिकाओं में कुल स्टोचस्टिक शोर को निर्धारित करने के लिए एक एल्गोरिदम प्रदान करती है, यह पाते हुए कि परिणाम प्रवाह विश्लेषक भविष्यवाणियों के अनुरूप हैं जैसा कि भिन्नता (सीवी) के समान गुणांक द्वारा दिखाया गया है।
Introduction
सिंथेटिक जीव विज्ञान एक बहुआयामी क्षेत्र है जो पिछले एक दशक में उभरा है और इसका उद्देश्य इंजीनियरिंग डिजाइन सिद्धांतों को तर्कसंगत जैविक डिजाइन 1 , 2,3में अनुवाद करना है , जो बुनियादी विज्ञान4,5, नैदानिक, चिकित्सीय और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगोंकोसमझने के लिए जीवित कोशिकाओं में बहु-संकेत एकीकरण और प्रसंस्करण प्राप्त करने के प्रयास में6,7, 8,9,10। सिंथेटिक जीन सर्किट के इनपुट-आउटपुट प्रतिक्रिया की मात्रा निर्धारित करने की हमारी क्षमता को एकल-कोशिका प्रौद्योगिकी में हाल की प्रगति से क्रांति आई है, जिसमें स्वचालित समय-चूक माइक्रोस्कोपी11का उपयोग करके प्रवाह विश्लेषक और लाइव सेल इमेजिंग शामिल हैं। एक फ्लो एनालाइजर का उपयोग अक्सर स्थिर अवस्था 1,12पर इन सर्किटों की प्रतिक्रिया को मापने के लिए कियाजाताहै और उल्टे माइक्रोस्कोपी का उपयोग एकल कोशिका 3 के स्तर पर सिंथेटिक जीन सर्किट की गतिशील प्रतिक्रिया को मापने के लिए कियाजाताहै । उदाहरण के लिए, सिंथेटिक जीव विज्ञान में शुरुआती कार्यों में से एक में देरी3के साथ नकारात्मक प्रतिक्रिया छोरों का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में आनुवंशिक आलसिलेटर नेटवर्क का निर्माण शामिल था। बाद में, जीवित कोशिकाओं के गतिशील वातावरण में मेटाबोलिक नियंत्रण को समझने के लिए आनुवंशिक आलसिलेटर सर्किट लागू किए गएथे 4। स्वचालित समय-चूक माइक्रोस्कोपी ऐसे सर्किट की विशेषता के लिए एक विधि है। हम परिकल्पना करते हैं कि मेजबान कोशिकाएं, एस्चेरिचिया कोलाई,सूक्ष्म उपनिवेश बनाते समय सिंक्रोनाइज करती हैं, सटीक मां-बेटी संबंधों को ट्रैक किए बिना सिग्नल और शोर की गणना की माप की अनुमति देती हैं।
शोर जैविक प्रणालियों का एक मौलिक, अंतर्निहित पहलू है जो अक्सर कई स्रोतों से उत्पन्न होता है। उदाहरण के लिए, जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं पर विचार करें जो संकेतों से उत्पन्न होते हैं जो प्रोटीन13के प्रसार जैसे असतत यादृच्छिक वाहकों के परिवहन से उत्पन्न होते हैं। ये संकेत14यादृच्छिक उतार – चढ़ाव के साथ प्रचारित करते हैं । अन्य शोर स्रोत संसाधन उपलब्धता, सेल डिवीजन और तापमान, आर्द्रता और दबाव जैसी पर्यावरणीय स्थितियों में भिन्नताएं हैं। सिंथेटिक जीन सर्किट में प्रचारित होने वाले जैविक संकेतों में अक्सर शोर अनुपात (एसएनआर) के लिए बहुत कम सिग्नल होता है, जो इस तरह के सर्किट के प्रदर्शन को परेशान करता है। इसलिए, जेनेटिक सर्किट डिजाइन जेनेटिक इंजीनियरिंग15के सबसे चुनौतीपूर्ण पहलुओं में से एक बना हुआ है। उदाहरण के लिए, अधिकांश दृष्टिकोणों के विपरीत जो केवल मतलब जीन अभिव्यक्ति (पूरी कोशिका आबादी पर मापा जाता है) की गणना करते हैं, सिंथेटिक जीन नेटवर्क12के माध्यम से उम्मीद के मुताबिक व्यवहार को इंजीनियर करने के लिए मापा संकेत के विचरण पर विचार किया जाता है। इस प्रकार, प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता या शोर का स्तर एनालॉग और डिजिटल जीन सर्किट1, 16,17के डिजाइन और प्रदर्शन में एक प्रमुख भूमिकानिभाताहै।
एस्चेरिचिया कोलाई3,7,18सहित सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। इन तरीकों का उपयोग अक्सर जीन सक्रियण और मेटाबोलिक रास्तों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, हालांकि स्टोचस्टिक शोर गतिशीलता के अध्ययन पर कम ध्यान केंद्रित करने के साथ, जैसे विशिष्ट शोर स्रोतों को मापने और अलग करना, विशेष रूप से जीवित कोशिकाओं में आनुवंशिक सर्किट के लिए जहां यह एक मौलिक चुनौती है19,20,21। कई कारक, दोनों सर्किट को विरासत में मिले (आंतरिक) और मेजबान कोशिकाओं (बाह्य) से प्राप्त, आनुवंशिक सर्किट के निरंतर प्रदर्शन को परेशान कर सकते हैं। इस पेपर में, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जिसका उद्देश्य एस्चेरिचिया कोलाई कोशिकाओं में कुल शोर को निर्धारित करना है, जिसमें आंतरिक और बाह्य शोर स्रोत6,22शामिल हैं। कुल शोर की मात्रा निर्धारित करके और फिर एसएनआर23का मूल्यांकन करके, जीन सर्किट के डिजाइन में सुधार किया जा सकता है। इस विधि को स्वतंत्र शोर स्रोतों को अलग से मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है, कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन6,20की निगरानी करके। यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लिए, हम पर्यावरणीय स्थितियों को अच्छी तरह से नियंत्रित रखते हैं और बाहरी कारकों के प्रभाव के बिना कोशिकाओं की गतिविधि को लगातार मापते हैं। हम समय के साथ एकल कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन से संकेत को मापते हैं और साथ ही उन्हें एक एगरेग्रेट सब्सट्रेट के तहत छवि देते हैं। परिणामस्वरूप छवियों प्रयोगशाला के कस्टम MATLAB का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं।
आदर्श रूप से, कोशिका के अंदर फ्लोरोसेंट प्रोटीन की वास्तविक समय गतिविधि का निरंतर मापन कोशिकाओं के विकास और विभाजन के माध्यम से सटीक डेटा का उत्पादन करेगा। हालांकि, इस तरह के आंकड़े हासिल करना चुनौतीपूर्ण है। यह फ्लोरोसेंट प्रोटीन के क्षरण के कारण होता है, जिसे फोटो-ब्लीचिंग 7 के नाम से जानाजाताहै, जब वे उत्तेजन प्रक्रिया में विकिरण के संपर्क में आते हैं। इसके अलावा, एस्चेरिचिया कोलाई कोशिकाएं भी उत्तेजन के लिए संवेदनशील हैं, जिससे फोटोटोक्सीसिटी7हो सकती है। दोनों मुद्दे फोटो फ्रेम की मात्रा को सीमित करते हैं जिन्हें अधिग्रहीत किया जा सकता है और अधिग्रहण के बीच का समय। इमेजिंग के दौरान कोशिकाओं को विकसित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सब्सट्रेट और मध्यम प्रकार (जैसे, lysogeny शोरबा) की भी महत्वपूर्ण भूमिका होती है। हम दृढ़ता से न्यूनतम माध्यम का उपयोग करने की सलाह देते हैं, जो गैर-फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि को कम करता है और सेल डिवीजन समय बढ़ाता है।
इसके अलावा, नमूना निम्नलिखित आवश्यकताओं को ध्यान में रखते हुए तैयार करने की जरूरत है (1) कम सेल डिवीजन दर डिवीजन चक्र को बारीकी से इमेजिंग करने और फोटोटॉक्सिसिटी और फोटोब्लैचिंग की संभावना को कम करने के लिए कम लगातार एक्सपोजर की अनुमति देता है। हम प्रयोग की शुरुआत में भविष्यवाणी की माइटोसिस समय (2) कम सेल घनत्व के बारे में आधे के लिए अधिग्रहण समय निर्धारित बेहतर एकरूपता और विभाजन की ट्रैकेबिलिटी के लिए अनुमति देता है । सेल घनत्व एस्चेरिचिया कोलाई कोशिकाओं के कमजोर पड़ने के अनुपात से प्रभावित होता है, जो इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है और हर प्रयोगशाला के लिए निर्धारित करने की जरूरत है। अनुपात स्थापित करने के लिए, प्रत्येक नए एस्चेरिचिया कोलाई तनाव या मीडिया का उपयोग विकास दर ग्राफ(अनुपूरक चित्रा 1)के साथ लगाया जाना चाहिए । एक उपयुक्त अनुपात प्राप्त किया गया है अगर कोशिकाओं के बारे में OD600nm = 0.1 के एक प्रारंभिक घनत्व से एक छोटी इनक्यूबेशन के बाद अतिरिक्त मिलाते हुए बिना विकसित कर सकते हैं। इस चरण में कोशिकाएं केवल पर्यावरण के तापमान (3) कोशिका आंदोलन के प्रतिबंध के अनुसार विभाजित होंगी: सेल आंदोलन दृढ़ता से सब्सट्रेट (एगर उठे पैड) दृढ़ता पर निर्भर करता है। सब्सट्रेट दृढ़ता कुल एगर उठे और जेल ठोस समय की मात्रा पर निर्भर करती है। जेल को कमरे के तापमान पर रात भर जमना नहीं छोड़ा जा सकता है, क्योंकि एस्चेरिचिया कोलाई को माइटोसिस से गुजरना होगा। सब्सट्रेट स्थिरता को प्रभावित करने वाले अन्य कारकों में नमूने और आर्द्रता में पानी की मात्रा शामिल है। प्रतिनिधि परिणामोंमें अतिरिक्त मुद्दों पर विस्तार से चर्चा की जाती है । यह प्रोटोकॉल कई विवरण प्रदान करता है और धीरे-धीरे एक कदम से दूसरे में जाता है। प्रोटोकॉल इमेजिंग प्रयोगों के लिए लंबी स्थिरता प्रदान करता है और एक बुनियादी छवि प्रसंस्करण उपकरण प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम में, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो एस्चेरिचिया कोलाई लाइव कोशिकाओं के कंप्यूटर ट्रेसिंग को सक्षम बनाता है, जो घंटों की अवधि में विभाजन और फ्लोरोसेंट स्तर के बाद होता है। यह प्रोटोकॉल ह?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मैटलैब कोड के साथ सहायता करने के लिए श्री गिल गेल्बर्ट (फैकल्टी ऑफ इलेक्ट्रिक इंजीनियरिंग, टेक्नोनियन) को धन्यवाद देते हैं। हम इस लेख को प्रूफ करने में सहायता करने के लिए डॉ Ximing ली (बायो मेडिकल इंजीनियरिंग, टेक्नोनियन के संकाय) को धन्यवाद देते हैं । इस शोध को आंशिक रूप से न्यूबॉयर फैमिली फाउंडेशन और इज़राइल मिनिस्ट्री ऑफ साइंस, ग्रांट 2027345 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD – Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD – Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD – Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
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