Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü
Summary
Bu çalışma, sentetik gen devrelerinin stokastik davranışının analizi ve nicelleştirilmesi için tek bir Escherichia coli hücresinin canlı görüntülenmesini sağlayan bir mikroskopi yöntemi sunun.
Abstract
Burada geliştirilen protokol, Escherichia coli bölümünün ve floresan seviyelerinin birkaç saat boyunca bilgisayar takibini sağlamak için bir araç sunmaktadır. Süreç, sadece doğru plazmidi barındıran Escherichia coli’nin belirli koşullarda gelişebileceğini varsayarak, minimum medyada hayatta kalan kolonileri tarayarak başlar. Birçok DNA parçasının montajını gerektiren büyük genetik devreler oluşturma süreci zor olduğundan, devre bileşenleri genellikle birkaç antibiyotik kullanılmasını gerektiren farklı kopya numaralarında birden fazla plazmid arasında dağıtılır. Plazmiddeki mutasyonlar antibiyotik direnci genlerinin transkripsiyonunu yok edebilir ve nekroza yol açan hücredeki kaynak yönetimi ile kesişebilir. Seçilen koloni cam tabanlı bir Petri kabına ayarlanır ve hem parlak alanda hem de floresan etki alanlarında mikroskopi takibi için birkaç odak düzlemi seçilir. Protokol, düzenlenemeyen ilk koşullar altında görüntü odağını 12 saatten fazla tutar ve birkaç zorluk yaratır. Örneğin, ölü hücreler birkaç saatlik görüntülemeden sonra lenslerin odak alanında birikmeye başlar, bu da toksinlerin birikmesine ve sinyalin bulanıklaşmasına ve çürümesine neden olur. Besinlerin tükenmesi yeni metabolik süreçleri tanıtır ve devrenin istenen yanıtını engeller. Deneyin sıcaklığı indükleyicilerin ve antibiyotiklerin etkisini düşürür ve bu da sinyalin güvenilirliğine daha fazla zarar verebilir. Minimum ortam jeli küçülür ve kurur ve sonuç olarak optik odak zamanla değişir. Bu yöntemi geliştirdik Escherichia coliDiğer mikro organizmalar için benzer yöntemler geliştiren önceki çalışmalara benzer. Buna ek olarak, bu yöntem değişmemiş ve değiştirilmiş hücrelerdeki toplam stokastik gürültüyü ölçmek için bir algoritma sunar ve sonuçların benzer bir değişim katsayısı (CV) ile gösterildiği gibi akış analizörü tahminleri ile tutarlı olduğunu bulur.
Introduction
Sentetik biyoloji, son on yılda ortaya çıkan ve mühendislik tasarım ilkelerini rasyonel biyolojik tasarım 1 , 2,3, temel bilimi anlamak için canlı hücrelerde çok sinyalli entegrasyon ve işlemeyi sağlamak amacıyla 4,5, tanısal, terapötik ve biyoteknolojik uygulamalar6,7,8,9,10‘a çevirmeyi amaçlayan multidisipliner bir alandır. Sentetik gen devrelerinin giriş-çıkış tepkisini ölçme yeteneğimiz, otomatik zaman atlamalı mikroskopi11kullanılarak akış analizörü ve canlı hücre görüntüleme de dahil olmak üzere tek hücreli teknolojideki son gelişmelerle devrime uğradı. Bir akış analizörü genellikle bu devrelerin tepkisini sabit durumda ölçmek için kullanılır1,12ve ters mikroskopi, sentetik gen devrelerinin dinamik tepkisini tek bir hücre düzeyinde ölçmek için kullanılır3. Örneğin, sentetik biyolojideki ilk çalışmalardan biri, gecikmeli negatif geri bildirim döngüleri kullanılarak canlı hücrelerde genetik osilatör ağlarının inşasını içeriyordu3. Daha sonra, canlı hücrelerin dinamik ortamında metabolik kontrolü anlamak için genetik osilatör devreleri uygulandı4. Otomatik zaman atlamalı mikroskopi, bu tür devreleri karakterize etmek için bir yöntemdir. Konak hücrelerin, Escherichia coli, mikro koloniler oluştururken senkronize olduğunu, tam anne-kız ilişkilerini izlemeden sinyal ölçümüne ve gürültünün hesaplanmasına izin verdiğini vardır.
Gürültü, biyolojik sistemlerin genellikle birden fazla kaynaktan kaynaklanan temel, doğal bir yönüdür. Örneğin, proteinlerin difüzyonu gibi ayrık rastgele taşıyıcıların taşınmasından kaynaklanan sinyalleri içeren biyokimyasal reaksiyonları düşünün13. Bu sinyaller rastgele dalgalanmalarla yayılır14. Diğer gürültü kaynakları kaynak kullanılabilirliği, hücre bölünmesi ve sıcaklık, nem ve basınç gibi çevresel koşullardaki farklılıklardır. Sentetik gen devrelerinde yayılan biyolojik sinyaller genellikle gürültü oranına (SNR) çok düşük bir sinyale sahiptir ve bu da bu tür devrelerin performansını bozmaktadır. Bu nedenle, genetik devre tasarımı genetik mühendisliğinin en zorlu yönlerinden biri olmaya devam etmektedir15. Örneğin, yalnızca ortalama gen ekspresyonunun hesapladığı çoğu yaklaşımın aksine (tüm hücre popülasyonu üzerinden ölçülür), sentetik gen ağları aracılığıyla öngörülebilir davranışı tasarlamak için ölçülen sinyalin varyansı dikkate alınır12. Bu nedenle, protein ifadesindeki değişkenlik veya gürültü seviyeleri, analog ve dijital gen devrelerinin tasarımında ve performansında baskın bir rol oynar1,16,17.
Escherichia coli3,7,18dahil olmak üzere hücreden hücreye değişkenliği ölçmek için birçok yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yöntemler genellikle gen aktivasyonunu ve metabolik yolları incelemek için kullanılır, ancak özellikle bunun temel bir zorluk olduğu canlı hücrelerdeki genetik devreler için belirli gürültü kaynaklarını ölçmek ve dağıtmak gibi stokastik gürültü dinamiklerinin incelenmesine daha az odaklanarak19,20,21. Hem devrenin kendisine miras kalan (içsel) hem de konak hücrelerden (dışsal) türetilen çeşitli faktörler genetik devrelerin sürekli performansını bozabilir. Bu yazıda, içsel ve dışsal gürültü kaynakları da dahil olmak üzere Escherichia coli hücrelerindeki toplam gürültüyü ölçmeyi amaçlayan bir protokol geliştirdik6,22. Toplam gürültüyü ölçerek ve daha sonra SNR23‘ü değerlendirerek gen devrelerinin tasarımı geliştirilebilir. Bu yöntem, birkaç floresanproteiniizleyerek bağımsız gürültü kaynaklarını ayrı ayrı ölçmek için değiştirilebilir 6,20. Burada açıklanan protokol için çevre koşullarını iyi kontrol altında tutuyor ve dış faktörlerin etkisi olmadan hücrelerin aktivitesini sürekli ölçüyoruz. Floresan proteinlerden gelen sinyali zaman içinde tek hücrelerde ölçtük ve aynı anda bir agarose substratı altında görüntüleyeceğiz. Elde edilen görüntüler laboratuvarın özel MATLAB’ı kullanılarak analiz edilir.
İdeal olarak, bir hücre içindeki floresan proteinlerin gerçek zamanlı aktivitesinin sürekli ölçümü, hücrelerin büyümesi ve bölünmesi yoluyla doğru veriler üretecektir. Ancak, bu tür verileri elde etmek zordur. Bunun nedeni, foto-ağartma7olarak bilinen floresan proteinlerin, heyecanlanma sürecinde radyasyona maruz kaldıklarında bozulmasıdır. Ayrıca, Escherichia coli hücreleri de fototoksiteye yol açabilecek heyecan için hassastır7. Her iki sorun da elde edilebilen fotoğraf karelerinin miktarını ve satın almalar arasındaki süreyi sınırlar. Görüntüleme sırasında hücreleri büyütmek için kullanılan substrat ve orta tipler (örneğin, lysogeny et suyu) da kritik bir role sahiptir. Floresan olmayan arka planı en aza indiren ve hücre bölünme süresini uzatan minimum ortam kullanmanızı öneririz.
Ayrıca, numunenin aşağıdaki gereksinimler göz önünde bulundurularak hazırlanması gerekir (1) Düşük hücre bölünme oranı, bölme döngüsünü yakından görüntülemek ve fototoksiklik ve fotobleaching olasılığını azaltmak için daha az sıklık pozlama sağlar. Edinme süresini öngörülen mitoz süresinin yaklaşık yarısına ayarladık (2) Deneyin başındaki düşük hücre yoğunluğu, bölünmenin daha iyi homojenliğini ve izlenebilirliğini sağlar. Hücre yoğunluğu, bu protokolün başarısı için önemli bir parametre olan ve her laboratuvar için belirlenmesi gereken Escherichia coli hücrelerinin seyreltme oranından etkilenir. Oranı belirlemek için, kullanılan her yeni Escherichia coli suşu veya ortamı büyüme hızı grafikleri ile donatılmalıdır(Tamamlayıcı Şekil 1). Hücreler yaklaşık600nm = 0.1 başlangıç yoğunluğundan kısa bir inkübasyondan sonra ek titreme olmadan büyüyebiliyorsa uygun bir oran elde edilmiştir. Bu aşamadaki hücreler sadece ortam sıcaklığına göre bölünür (3) Hücre hareketinin kısıtlanması: hücre hareketi güçlü bir şekilde substrat (agarose pad) sıkılığına bağlıdır. Substrat sıkılığı toplam agarose miktarına ve jel katılaşma süresine bağlıdır. Escherichia coli mitoz geçireceğinden, jeller oda sıcaklığında bir gecede katılaşmaya bırakılamaz. Substrat stabilitesini etkileyen diğer faktörler arasında numunedeki su miktarı ve nem sayar. Ek konular Temsilci Sonuçları ‘nda ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Bu protokol birçok ayrıntı sağlar ve yavaş yavaş bir adımdan diğerine geçer. Protokol, görüntüleme deneyleri için uzun kararlılık sunar ve temel bir görüntü işleme aracı sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, Escherichia coli canlı hücrelerinin bilgisayar izlemesini sağlayan, bir saat boyunca bölünme ve floresan seviyelerini takip eden bir protokol geliştirdik. Bu protokol, CV ve SNR’yi gerçek zamanlı olarak ölçerek Escherichia coli’deki genetik devrelerin stokastik dinamiklerini ölçmemizi sağlar. Bu protokolde şekil 10’dagösterildiği gibi iki farklı devrenin stokastik davranışlarını karşılaştırdık. Düşük kopya numaralarına sahip plazmidlerin st…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Matlab koduna yardımcı olduğu için Bay Gil Gelbert’e (Elektrik Mühendisliği Fakültesi, Technion) teşekkür ederiz. Dr. Ximing Li’ye (Technion Biyo-Tıp Mühendisliği Fakültesi) bu makalenin kanıtlanmasına yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Neubauer Aile Vakfı ve İsrail Bilim Bakanlığı tarafından kısmen desteklendi, grant 2027345.
Materials
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD – Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD – Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD – Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
Riferimenti
- Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
- Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. . Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).
- Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
- Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
- Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
- Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
- Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
- Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
- Nielsen, A. A. K., et al. Genetic circuit design automation. Science. , (2016).
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
- Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. , (2014).
- Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
- Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. . Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
- Van Der Ziel, A. . Noise in Measurements. , (1976).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
- Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. . SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells – Stylianidou – 2016 – Molecular Microbiology. , (2016).
- Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
- Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
- Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
- Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
- Marr, D., Hildreth, E. Theory of edge detection. Proceedings of the Royal Society – Biology Science. 207, 187-217 (1980).
- Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
- Soille, P. . Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
- Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
- Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
- Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).
