Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia Coli utilizzando la microscopia time-lapse

Summary

Questo lavoro presenta un metodo di microscopia che consente l’imaging vivo di una singola cellula di Escherichia coli per l’analisi e la quantificazione del comportamento stocastico dei circuiti genetici sintetici.

Abstract

Il protocollo qui sviluppato offre uno strumento per consentire il tracciamento informatico della divisione Escherichia coli e dei livelli fluorescenti per diverse ore. Il processo inizia attraverso lo screening per le colonie che sopravvivono su supporti minimi, supponendo che solo Escherichia coli che ospita il plasmide corretto sarà in grado di prosperare nelle condizioni specifiche. Poiché il processo di costruzione di grandi circuiti genetici, che richiedono l’assemblaggio di molte parti del DNA, è impegnativo, i componenti del circuito sono spesso distribuiti tra più plasmidi a diversi numeri di copia che richiedono l’uso di diversi antibiotici. Le mutazioni nel plasmide possono distruggere la trascrizione dei geni di resistenza agli antibiotici e interiettare con la gestione delle risorse nella cellula che porta alla necrosi. La colonia selezionata è impostata su una piastra di Petri con fondo di vetro e alcuni piani di messa a fuoco sono selezionati per il tracciamento della microscopia sia in campo luminoso che in domini fluorescenti. Il protocollo mantiene lo stato attivo dell’immagine per più di 12 ore in condizioni iniziali che non possono essere regolamentate, creando alcune difficoltà. Ad esempio, le cellule morte iniziano ad accumularsi nel campo di messa a fuoco delle lenti dopo alcune ore di imaging, il che causa l’accumulo di tossine e la sfocatura e il decadimento del segnale. L’esaurimento dei nutrienti introduce nuovi processi metabolici e ostacola la risposta desiderata del circuito. La temperatura dell’esperimento abbassa l’effettività di induttori e antibiotici, il che può danneggiare ulteriormente l’affidabilità del segnale. Il gel multimediale minimo si restringe e si asciuga e, di conseguenza, la messa a fuoco ottica cambia nel tempo. Abbiamo sviluppato questo metodo per superare queste sfide in Escherichia coli, simile ai lavori precedenti che sviluppano metodi analoghi per altri microrganismi. Inoltre, questo metodo offre un algoritmo per quantificare il rumore stocastico totale nelle celle inaltere e alterate, scoprendo che i risultati sono coerenti con le previsioni dell’analizzatore di flusso come mostrato da un coefficiente di variazione simile (CV).

Introduction

La biologia sintetica è un campo multidisciplinare emerso nell’ultimo decennio e mira a tradurre i principi di progettazione ingegneristica in progettazione biologica^{razionale 1,2,3,}nel tentativo di raggiungere l’integrazione e l’elaborazione multi-segnale nelle cellule viventi per comprendere la scienza di^{base 4,5,}applicazioni diagnostiche, terapeutiche e^{biotecnologiche 6,7,8,9,10}. La nostra capacità di quantificare la risposta input-output dei circuiti genetici sintetici è stata rivoluzionata dai recenti progressi nella tecnologia a cella singola, tra cui l’analizzatore di flusso e l’imaging di cellule vive utilizzando la microscopia automatica time-lapse¹¹. Un analizzatore di flusso viene spesso utilizzato per misurare la risposta di questi circuiti allo stato^{stazionario 1,12}e la microscopia invertita viene utilizzata per misurare la risposta dinamica dei circuiti genetici sintetici a livello di una singola cella³. Ad esempio, uno dei primi lavori in biologia sintetica ha comportato la costruzione di reti di oscillatori genetici in cellule viventi utilizzando cicli di feedback negativi con un ritardo^{di 3}. Successivamente, i circuiti genetici dell’oscillatore sono stati applicati per comprendere il controllo metabolico nell’ambiente dinamico delle cellule^{viventi 4}. La microscopia automatica time-lapse è un metodo per caratterizzare tali circuiti. Ipotizziamo che le cellule ospiti, Escherichia coli, si sincronizzino quando formano micro colonie, consentendo la misurazione del segnale e il calcolo del rumore senza tracciare relazioni esatte madre-figlia.

Il rumore è un aspetto fondamentale e intrinseco dei sistemi biologici spesso derivanti da più fonti. Si consideri, ad esempio, le reazioni biochimiche che coinvolgono segnali che provengono dal trasporto di vettori casuali discreti come la diffusione delle proteine¹³. Questi segnali si propagano con fluttuazioni casuali¹⁴. Altre fonti di rumore sono la disponibilità di risorse, la divisione cellulare e le variazioni delle condizioni ambientali come temperatura, umidità e pressione. I segnali biologici che si propagano nei circuiti genetici sintetici hanno spesso un rapporto segnale/rumore molto basso (SNR), che disturba le prestazioni di tali circuiti. Pertanto, la progettazione di circuiti genetici rimane uno degli aspetti più impegnativi dell’ingegneria^{genetica 15}. Ad esempio, a differenza della maggior parte degli approcci che calcolano solo l’espressione genica media (misurata sull’intera popolazione cellulare), la varianza del segnale misurato è considerata al fine di progettare un comportamento prevedibile attraverso reti geniche^{sintetiche 12}. Come tale, i livelli di variabilità o rumore nell’espressione proteica svolgono un ruolo dominante nella progettazione e nelle prestazioni dei circuiti genetici analogici e digitali^1,16,17.

Sono stati sviluppati molti approcci per quantificare la variabilità da cellula a cellula, tra cui in Escherichia coli^3,7,18. Questi metodi sono spesso utilizzati per studiare l’attivazione genica e le vie metaboliche, tuttavia con minore attenzione allo studio della dinamica del rumore stocastico, come la misurazione e la districazione di specifiche fonti di rumore, in particolare per i circuiti genetici nelle cellule viventi dove questa è una^{sfida fondamentale 19,20,21}. Diversi fattori, entrambi ereditati dal circuito stesso (intrinseco) e derivati dalle cellule ospiti (estrinsece), possono disturbare le prestazioni continue dei circuiti genetici. In questo documento, abbiamo sviluppato un protocollo che mira a quantificare il rumore totale nelle cellule di Escherichia coli, comprese le fonti di rumore intrinseche ed estrinsece^6,22. Quantificando il rumore totale e quindi valutando l’SNR²³, è possibile migliorare la progettazione dei circuiti genetici. Questo metodo può essere modificato per misurare separatamente le fonti di rumore indipendenti, monitorando diverse proteine^{fluorescenti 6,20}. Per il protocollo qui descritto, manteniamo le condizioni ambientali ben controllate e misuriamo continuamente l’attività delle cellule senza l’influenza di fattori esterni. Misuriamo il segnale dalle proteine fluorescenti in singole cellule nel tempo e contemporaneamente le immaginiamo sotto un substrato di agarosio. Le immagini risultanti vengono analizzate utilizzando il MATLAB personalizzato del laboratorio.

Idealmente, la misurazione continua dell’attività in tempo reale delle proteine fluorescenti all’interno di una cellula produrrà dati accurati attraverso la crescita e la divisione delle cellule. Tuttavia, è difficile acquisire tali dati. Ciò è dovuto alla degradazione delle proteine fluorescenti, note come foto-sbiancamento⁷, quando sono esposte a radiazioni nel processo di eccitazione. Inoltre, le cellule di Escherichia coli sono sensibili anche per l’eccitazione, che potrebbe portare alla fototossicità⁷. Entrambi i problemi limitano la quantità di cornici che possono essere acquisite e il tempo tra le acquisizioni. Anche il substrato e i tipi medi (ad esempio il brodo di licogenia) che viene utilizzato per far crescere le cellule durante l’imaging hanno un ruolo critico. Si consiglia vivamente di utilizzare un mezzo minimo, che riduce al minimo lo sfondo non fluorescente ed estende il tempo di divisione cellulare.

Inoltre, il campione deve essere preparato considerando i seguenti requisiti (1) Il basso tasso di divisione cellulare consente esposizioni meno frequenti per l’imaging da vicino del ciclo di divisione e la riduzione della probabilità di fototossicità e fotoblesaching. Abbiamo impostato il tempo di acquisizione su circa la metà del tempo di mitosi previsto (2) La bassa densità cellulare all’inizio dell’esperimento consente una migliore uniformità e tracciabilità della divisione. La densità cellulare è influenzata dal rapporto di diluizione delle cellule di Escherichia coli, che è un parametro significativo per il successo di questo protocollo e deve essere determinato per ogni laboratorio. Per stabilire il rapporto, ogni nuovo ceppo o supporto di Escherichia coli utilizzato dovrebbe essere dotato di grafici del tasso di crescita(figura complementare 1). Un rapporto appropriato è stato raggiunto se le cellule possono crescere senza ulteriori scosse dopo una breve incubazione da una densità iniziale di circa_600nm di OD = 0,1. Le cellule in questa fase si divideranno solo in base alla temperatura dell’ambiente (3) Restrizione del movimento cellulare: il movimento cellulare dipende fortemente dalla compattezza del substrato (tampone di agarosio). La compattezza del substrato dipende dalla quantità di agarosio totale e dal tempo di solidificazione del gel. I gel non possono essere lasciati solidificare durante la notte a temperatura ambiente, poiché l’Escherichia coli subirà la mitosi. Altri fattori che influenzano la stabilità del substrato includono la quantità di acqua nel campione e l’umidità. Ulteriori questioni sono discusse in dettaglio nei risultati rappresentativi. Questo protocollo fornisce molti dettagli e si sposta gradualmente da un passo all’altro. Il protocollo offre una lunga stabilità per gli esperimenti di imaging e fornisce uno strumento di elaborazione delle immagini di base.

Protocol

1. Preparazione dei media e della cultura Preparare una soluzione stock di 1.000x carbenicillina (50 mg/mL) o antibiotico pertinente. . Pesare 0,5 g di carbenicillina. Aggiungere 10 mL di sterile H2O. Sciogliere completamente. Sterilizzare lo stock di carbenicillina attraverso un filtro siringa da 0,22 μm. Aliquota la soluzione antibiotica e conservare a -20 °C. Per preparare piatti di brodo di lisogenia (LB), mescolare 5 g di triptone, 5 g…

Representative Results

Il software analizza le immagini del dominio di campo luminoso che sono bianche e nere. L’Escherichia coli sarà simile a forme oblunghe nere su uno sfondo bianco troppo bianco e la gamma dinamica di luminanza dovrebbe mostrare un picco al centro (Figura 1). Nelle immagini fluorescenti le cellule possono avere un piccolo alone, ma le singole cellule con forme oblunghe possono ancora essere risolte. Un evento di mitosi deve essere rilevato per la prima volta dopo 30 minuti. La messa …

Discussion

In questo lavoro, abbiamo sviluppato un protocollo che consente il tracciamento computerico delle cellule vive di Escherichia coli, seguendo livelli di divisione e fluorescenti per un periodo di ore. Questo protocollo ci permette di quantificare le dinamiche stocastiche dei circuiti genetici in Escherichia coli misurando il CV e l’SNR in tempo reale. In questo protocollo, abbiamo confrontato i comportamenti stocastica di due circuiti diversi come mostrato nella Figura 10. È stato dimos…

Materials

35mm glass dish	mattek	P35G-0.170-14-C	thickness corresponding with microscope lense.
Agarose	Lonza	5004	LB preperation
AHL	Sigma-Aldrich	K3007	inducer
Bacto tryptone	BD – Becton, Dickinson and Company	211705	LB preperation
Carb	Invitrogen	10177-012	antibiotic
Carb	Formedium	CAR0025	antibiotic
Casamino acids	BD – Becton, Dickinson and Company	223050	minimal media solution
eclipse Ti	nikon		inverted microscope
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	minimal media solution
Glyserol	Bio-Lab	000712050100	minimal media substrate
Immersol 518F	zeiss	4449600000000	immersion oil
M9 salt solution	Sigma-Aldrich	M6030	minimal media solution
NaCl	Bio-Lab	214010	LB preperation
Noble agar	Sigma-Aldrich	A5431	minimal media substrate
parafilm tape	Bemis	PM-996	refered to as tape in text
Seaplaque GTG Agarose	Lonza	50111	minimal media substrate
thaymine B1	Sigma-Aldrich	T0376	minimal media solution
Yeast Extract	BD – Becton, Dickinson and Company	212750	LB preperation