Medición continua del ruido biológico en Escherichia Coli mediante microscopía de lapso de tiempo

Summary

Este trabajo presenta un método de microscopía que permite la toma de imágenes en vivo de una sola célula de Escherichia coli para el análisis y cuantificación del comportamiento estocástico de los circuitos genéticos sintéticos.

Abstract

El protocolo desarrollado aquí ofrece una herramienta para permitir el seguimiento por computadora de la división Escherichia coli y los niveles fluorescentes durante varias horas. El proceso comienza por la detección de colonias que sobreviven en medios mínimos, suponiendo que sólo Escherichia coli que alberga el plásmido correcto será capaz de prosperar en las condiciones específicas. Dado que el proceso de construcción de grandes circuitos genéticos, que requieren el montaje de muchas partes del ADN, es un desafío, los componentes del circuito a menudo se distribuyen entre plásmidos múltiples en diferentes números de copia que requieren el uso de varios antibióticos. Las mutaciones en el plásmido pueden destruir la transcripción de los genes de resistencia a los antibióticos e interpelar con el manejo de los recursos en la célula que conduce a la necrosis. La colonia seleccionada está situada en una placa Petri con fondo de cristal y algunos planos de enfoque se seleccionan para el seguimiento de microscopía tanto en campos brillantes como en dominios fluorescentes. El protocolo mantiene el enfoque de imagen durante más de 12 horas en condiciones iniciales que no se pueden regular, creando algunas dificultades. Por ejemplo, las células muertas comienzan a acumularse en el campo de enfoque de las lentes después de unas horas de imágenes, lo que hace que las toxinas se acumulen y la señal se desenfoque y decaiga. El agotamiento de nutrientes introduce nuevos procesos metabólicos y dificulta la respuesta deseada del circuito. La temperatura del experimento reduce la efectividad de los inductores y los antibióticos, lo que puede dañar aún más la fiabilidad de la señal. El gel de medios mínimo se encoge y se seca, y como resultado el enfoque óptico cambia con el tiempo. Desarrollamos este método para superar estos desafíos en Escherichia coli,similar a trabajos anteriores que desarrollan métodos análogos para otros microorganismos. Además, este método ofrece un algoritmo para cuantificar el ruido estocástico total en celdas sin modificar y alteradas, encontrando que los resultados son consistentes con las predicciones del analizador de flujo como se muestra en un coeficiente similar de variación (CV).

Introduction

La biología sintética es un campo multidisciplinar que ha surgido en la última década y tiene como objetivo traducir los principios de diseño de ingeniería en diseño biológico racional^1,2,3,en un esfuerzo por lograr la integración y procesamiento multi-señal en células vivas para entender la ciencia básica^4,5,aplicaciones diagnósticas, terapéuticas y biotecnológicas^6,7,8,9,10. Nuestra capacidad para cuantificar la respuesta de entrada y salida de los circuitos genéticos sintéticos se ha visto revolucionada por los recientes avances en la tecnología unicelular, incluido el analizador de flujo y las imágenes de células vivas mediante microscopía automatizada de lapso de tiempo^11. A menudo se utiliza un analizador de flujo para medir la respuesta de estos circuitos en el estado estacionaria^1,12,y la microscopía invertida se utiliza para medir la respuesta dinámica de los circuitos genéticos sintéticos a nivel de una sola célula^3. Por ejemplo, uno de los primeros trabajos en biología sintética implicó la construcción de redes de osciladores genéticos en células vivas utilizando bucles de retroalimentación negativos con un retraso^{de 3}. Más tarde, los circuitos osciladores genéticos se aplicaron para entender el control metabólico en el entorno dinámico de las células vivas^4. La microscopía automatizada de lapso de tiempo es un método para caracterizar estos circuitos. Suponemos que las células huésped, Escherichia coli,se sincronizan al formar micro colonias, permitiendo la medición de la señal y el cálculo del ruido sin rastrear las relaciones exactas madre-hija.

El ruido es un aspecto fundamental e inherente de los sistemas biológicos que a menudo surgen de múltiples fuentes. Consideremos, por ejemplo, las reacciones bioquímicas que implican señales que se originan en el transporte de portadores aleatorios discretos, como la difusión de proteínas^13. Estas señales se propagan con fluctuaciones aleatorias¹⁴. Otras fuentes de ruido son la disponibilidad de recursos, la división celular y las variaciones en condiciones ambientales como la temperatura, la humedad y la presión. Las señales biológicas que se propagan en circuitos genéticos sintéticos a menudo tienen una relación señal-ruido (SNR) muy baja, lo que perturba el rendimiento de dichos circuitos. Por lo tanto, el diseño de circuitos genéticos sigue siendo uno de los aspectos más desafiantes de la ingeniería genética^15. Por ejemplo, a diferencia de la mayoría de los enfoques que calculan sólo la expresión génica media (medida sobre toda la población celular), la varianza de la señal medida se considera con el fin de diseñar un comportamiento predecible a través de redes genéticas sintéticas¹². Como tal, los niveles de variabilidad o ruido en la expresión proteica desempeñan un papel dominante en el diseño y el rendimiento de los circuitos genéticos analógicos y digitales^1,16,17.

Se han desarrollado muchos enfoques para cuantificar la variabilidad de célula a célula, incluso en Escherichia coli^3,7,18. Estos métodos se utilizan a menudo para estudiar la activación genética y las vías metabólicas, sin embargo, con menos enfoque en el estudio de la dinámica del ruido estocástico, como medir y desenredar fuentes de ruido específicas, especialmente para los circuitos genéticos en las células vivas donde este es un desafío fundamental^19,20,21. Varios factores, tanto heredados al propio circuito (intrínsecos) como derivados de las células huésped (extrínsecos), pueden perturbar el rendimiento continuo de los circuitos genéticos. En este documento, desarrollamos un protocolo que tiene como objetivo cuantificar el ruido total en las células de Escherichia coli, incluidas las fuentes de ruido intrínsecas y extrínsecas^6,22. Al cuantificar el ruido total y luego evaluar el SNR^23,se puede mejorar el diseño de los circuitos genéticos. Este método se puede modificar para medir fuentes de ruido independientes por separado, mediante la monitorización de varias proteínas fluorescentes^6,20. Para el protocolo descrito aquí, mantenemos las condiciones ambientales bien controladas y medimos continuamente la actividad de las células sin la influencia de factores externos. Medimos la señal de las proteínas fluorescentes en células individuales con el tiempo y las imagen simultáneamente bajo un sustrato de agarose. Las imágenes resultantes se analizan utilizando el MATLAB personalizado del laboratorio.

Idealmente, la medición continua de la actividad en tiempo real de las proteínas fluorescentes dentro de una célula producirá datos precisos a través del crecimiento y la división de las células. Sin embargo, es difícil adquirir esos datos. Esto se debe a la degradación de las proteínas fluorescentes, conocidas como foto-blanqueamiento^7,cuando están expuestas a la radiación en el proceso de excitación. Además, las células de Escherichia coli también son sensibles para la excitación, lo que podría conducir a la fototoxicidad^7. Ambas emisiones limitan la cantidad de marcos de fotos que se pueden adquirir y el tiempo entre adquisiciones. El sustrato y los tipos medios (por ejemplo, caldo de lisógena) que se utiliza para cultivar las células durante la toma de imágenes también tienen un papel crítico. Recomendamos encarecidamente el uso de un medio mínimo, que minimice el fondo no fluorescente y amplíe el tiempo de división celular.

Además, la muestra debe prepararse teniendo en cuenta los siguientes requisitos (1) La baja tasa de división celular permite exposiciones menos frecuentes para realizar imágenes cercanas del ciclo de división y reducir la probabilidad de fototoxicidad y fotobleaching. Establecemos el tiempo de adquisición en aproximadamente la mitad del tiempo de mitosis pronosticado (2) La baja densidad celular al comienzo del experimento permite una mejor uniformidad y seguimiento de la división. La densidad celular se ve afectada por la relación de dilución de las células de Escherichia coli, que es un parámetro significativo para el éxito de este protocolo y debe determinarse para cada laboratorio. Para establecer la relación, cada nueva cepa o medio de Escherichia coli utilizado debe estar equipado con gráficos de tasa de crecimiento(Figura Suplementaria 1). Se ha logrado una relación adecuada si las células pueden crecer sin agitación adicional después de una breve incubación de una densidad inicial de aproximadamente_600nm OD = 0.1. Las células en esta fase se dividirán de acuerdo con la temperatura ambiente solamente (3) Restricción del movimiento celular: el movimiento celular depende fuertemente de la firmeza del sustrato (almohadilla de agarose). La firmeza del sustrato depende de la cantidad de agarose total y el tiempo de solidificación del gel. Los geles no se pueden dejar solidificar durante la noche a temperatura ambiente, ya que la Escherichia coli se someterá a mitosis. Otros factores que afectan la estabilidad del sustrato incluyen la cantidad de agua en la muestra y la humedad. Las cuestiones adicionales se examinan en detalle en los Resultados del Representante. Este protocolo proporciona muchos detalles y se mueve gradualmente de un paso a otro. El protocolo ofrece una larga estabilidad para experimentos de imágenes y proporciona una herramienta básica de procesamiento de imágenes.

Protocol

1. Preparación de los medios de comunicación y la cultura Preparar solución de stock de 1.000x carbenicilina (50 mg/ml) o antibiótico relevante. . Pesar 0,5 g de carbenicilina. Añadir 10 ml de estéril H2O. Disolver por completo. Esterilizar el stock de carbenicilina a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm. Aliquot la solución antibiótica y almacenar a -20 °C. Para preparar placas de caldo de lisógena (LB), mezcle 5 g de tripto…

Representative Results

El software analiza imágenes de dominio de campo brillante que son fuera de blanco y negro. La Escherichia coli se verá como formas oblongas negras sobre un fondo blanquecino y el rango dinámico de luminancia debe mostrar un pico en su centro(Figura 1). En las imágenes fluorescentes las células pueden tener un halo pequeño, pero las células individuales con formas oblongas todavía se pueden resolver. Primero se debe detectar un evento de mitosis después de 30 minutos. El en…

Discussion

En este trabajo, desarrollamos un protocolo que permite el rastreo por ordenador de células vivas de Escherichia coli, siguiendo niveles de división y fluorescentes durante un período de horas. Este protocolo nos permite cuantificar la dinámica estocástica de los circuitos genéticos en Escherichia coli midiendo el CV y el SNR en tiempo real. En este protocolo, comparamos los comportamientos estocásticos de dos circuitos diferentes como se muestra en la Figura 10. Se ha demostrado…

Materials

35mm glass dish	mattek	P35G-0.170-14-C	thickness corresponding with microscope lense.
Agarose	Lonza	5004	LB preperation
AHL	Sigma-Aldrich	K3007	inducer
Bacto tryptone	BD – Becton, Dickinson and Company	211705	LB preperation
Carb	Invitrogen	10177-012	antibiotic
Carb	Formedium	CAR0025	antibiotic
Casamino acids	BD – Becton, Dickinson and Company	223050	minimal media solution
eclipse Ti	nikon		inverted microscope
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	minimal media solution
Glyserol	Bio-Lab	000712050100	minimal media substrate
Immersol 518F	zeiss	4449600000000	immersion oil
M9 salt solution	Sigma-Aldrich	M6030	minimal media solution
NaCl	Bio-Lab	214010	LB preperation
Noble agar	Sigma-Aldrich	A5431	minimal media substrate
parafilm tape	Bemis	PM-996	refered to as tape in text
Seaplaque GTG Agarose	Lonza	50111	minimal media substrate
thaymine B1	Sigma-Aldrich	T0376	minimal media solution
Yeast Extract	BD – Becton, Dickinson and Company	212750	LB preperation