Charakterisierung der Intra-Knorpel-Transporteigenschaften von Kationischen Peptidträgern
Summary
Dieses Protokoll bestimmt die Gleichgewichtsaufnahme, die Penetrationstiefe und die Nicht-Gleichgewichtsdiffusionsrate für kationische Peptidträger im Knorpel. Die Charakterisierung der Transporteigenschaften ist entscheidend für die Gewährleistung einer effektiven biologischen Reaktion. Diese Methoden können für die Entwicklung eines optimal geladenen Arzneimittelträgers zur Ausrichtung negativ geladener Gewebe angewendet werden.
Abstract
Mehrere negativ geladene Gewebe im Körper, wie Knorpel, stellen eine Barriere für die gezielte Medikamentenabgabe aufgrund ihrer hohen Dichte von negativ geladenen Aggrecans dar und erfordern daher verbesserte Targeting-Methoden, um ihre therapeutische Reaktion zu erhöhen. Da Knorpel eine hohe negative feste Ladungsdichte aufweist, können Medikamente mit positiv geladenen Arzneimittelträgern modifiziert werden, um elektrostatische Wechselwirkungen zu nutzen, was einen verbesserten Intra-Knorpel-Drogentransport ermöglicht. Die Untersuchung des Transports von Drogenträgern ist daher von entscheidender Bedeutung für die Vorhersage der Wirksamkeit von Arzneimitteln bei der Induktion einer biologischen Reaktion. Wir zeigen das Design von drei Experimenten, die die Gleichgewichtsaufnahme, die Penetrationstiefe und die Nicht-Gleichgewichtsdiffusionsrate von kationischen Peptidträgern in Knorpelexaten quantifizieren können. Gleichgewichtsaufnahmeexperimente liefern ein Maß für die gelöste Konzentration innerhalb des Knorpels im Vergleich zu seinem umgebenden Bad, was nützlich ist, um das Potenzial eines Arzneimittelträgers bei der Verbesserung der therapeutischen Konzentration von Medikamenten im Knorpel vorherzusagen. Die Tiefenderdringungsstudien mittels konfokaler Mikroskopie ermöglichen die visuelle Darstellung der 1D-gelösten Diffusion von der oberflächlichen in die tiefe Knorpelzone, was wichtig für die Beurteilung ist, ob Solutes ihre Matrix- und Zellzielstellen erreichen. Nicht-Gleichgewichtsdiffusionsratenstudien mit einer kundenspezifischen Transportkammer ermöglichen die Messung der Stärke von Bindungswechselwirkungen mit der Gewebematrix, indem die Diffusionsraten fluoreszierend markierter Gelöstheitim Gewebe charakterisiert werden; dies ist vorteilhaft für die Gestaltung von Trägern mit optimaler Bindungsfestigkeit mit Knorpel. Zusammen liefern die Ergebnisse der drei Transportexperimente eine Richtlinie für die Entwicklung optimal aufgeladener Arzneimittelträger, die schwache und reversible Ladungsinteraktionen für Arzneimittelabgabeanwendungen nutzen. Diese experimentellen Methoden können auch angewendet werden, um den Transport von Drogen und Drogenträger-Konjugaten zu bewerten. Darüber hinaus können diese Methoden für den Einsatz bei der Ausrichtung auf andere negativ geladene Gewebe wie Meniskus, Hornhaut und den Glaskörper Humor angepasst werden.
Introduction
Die Medikamentenabgabe an negativ geladene Gewebe im Körper bleibt eine Herausforderung aufgrund der Unfähigkeit von Medikamenten, tief in das Gewebe einzudringen, um Zell- und Matrix-Zielstellen zu erreichen1. Einige dieser Gewebe bestehen aus dicht gepackten, negativ geladenen Aggrecanen, die eine hohe negative feste Ladungsdichte (FCD)2 im Gewebe erzeugen und als Barriere für die Abgabe der meisten Makromoleküle3,4fungieren. Mit Hilfe von positiv geladenen Drogenträgern kann diese negativ geladene Gewebebarriere jedoch tatsächlich über elektrostatische Ladungswechselwirkungen für die nachhaltige Medikamentenabgabe1,5,6,7( Abbildung1) in ein Arzneimitteldepot umgewandelt werden.
Abbildung 1: Gebührenbasierte Intraknorpellieferung von CPCs. Intraartikuläre Injektion von CPCs in den Kniegelenksraum. Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen positiv geladenen CPCs und negativ geladenen Aggrecangruppen ermöglichen eine schnelle und vollständige Tiefendurchdringung durch Knorpel. Diese Zahl wurde von Vedadghavami et al4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Kürzlich wurden kurzdurchdachte kationische Peptidträger (CPCs) mit dem Ziel entwickelt, kleine kationische Domänen zu schaffen, die größere Therapeutika zur Abgabe an den negativ geladenen Knorpel4transportieren können. Für eine wirksame Medikamentenabgabe an den Knorpel zur Behandlung von vorherrschenden8,,9 und degenerativen Erkrankungen wie Arthrose (OA)10ist es entscheidend, dass therapeutische Konzentrationen von Medikamenten tief in das Gewebe eindringen, wo ein Großteil der Knorpelzellen (Chondrozyten)11liegen. Obwohl es mehrere potenzielle Krankheit modifizierende Medikamente zur Verfügung, keine haben FDA-Zulassung erhalten, weil diese nicht in der Lage sind, effektiv den Knorpel12,13. Daher ist die Bewertung der Transporteigenschaften von Arzneimittelträgern notwendig, um die Wirksamkeit von Medikamenten bei der Induktion einer therapeutischen Reaktion vorherzusagen. Hier haben wir drei separate Experimente entwickelt, die zur Beurteilung der Gleichgewichtsaufnahme, der Penetrationstiefe und der Nicht-Gleichgewichtsdiffusionsrate von CPCs4verwendet werden können.
Um eine ausreichende Wirkstoffkonzentration im Knorpel zu gewährleisten, die eine optimale therapeutische Reaktion bieten kann, wurden Aufnahmeexperimente entwickelt, um die Gleichgewichtskonzentration der CPC im Knorpel zu quantifizieren4. Bei dieser Konstruktion kann nach einem Gleichgewicht zwischen dem Knorpel und seinem umgebenden Bad die Gesamtmenge der Gelösten im Knorpel (entweder an die Matrix gebunden oder frei) anhand eines Aufnahmeverhältnisses bestimmt werden. Dieses Verhältnis wird berechnet, indem die Konzentration der Gelösten im Knorpel auf die des Gleichgewichtsbades normalisiert wird. Grundsätzlich hätten neutrale Gelösthemmer, deren Diffusion durch den Knorpel nicht durch Ladungswechselwirkungen unterstützt wird, ein Aufnahmeverhältnis von weniger als 1. Umgekehrt weisen kationische Gelöste, deren Transport durch elektrostatische Wechselwirkungen verbessert wird, ein Aufnahmeverhältnis von mehr als 1 auf. Wie bei CPCs gezeigt, kann die Verwendung einer optimalen positiven Ladung jedoch zu wesentlich höheren Aufnahmeverhältnissen (größer als 300)4führen.
Obwohl eine hohe Medikamentenkonzentration im Knorpel wichtig ist, um therapeutischen Nutzen zu erzielen, ist es auch wichtig, dass Medikamente durch die volle Dicke des Knorpels diffundieren. Daher sind Studien erforderlich, die die Tiefe der Penetration zeigen, um sicherzustellen, dass Medikamente tief in den Knorpel gelangen, so dass die Matrix- und zellulären Zielstellen erreicht werden können, wodurch eine effektivere Therapie ermöglicht wird. Dieses Experiment wurde entwickelt, um die einseitige Diffusion von Gelösten durch Knorpel zu bewerten und die Diffusion von Medikamenten in Knorpel nach intraartikulärer Injektion in vivo zu simulieren. Fluoreszenz-Bildgebung mittels konfokaler Mikroskopie ermöglicht die Beurteilung der Eindringtiefe in Knorpel. Die Nettopartikelladung spielt eine Schlüsselrolle bei der Moderation, wie tiefe Medikamente durch die Matrix diffundieren können. Eine optimale Nettoladung auf Basis eines Gewebe-FCD ist erforderlich, um schwach-reversible Bindungswechselwirkungen zwischen kationischen Partikeln und der anionischen Gewebematrix zu ermöglichen. Dies impliziert, dass jede Wechselwirkung schwach genug ist, so dass Teilchen sich von der Matrix trennen können, aber in der Natur reversibel sind, so dass sie an eine andere Matrixbindungsstelle tiefer im Gewebe binden kann4. Umgekehrt kann eine übermäßige positive Nettoladung eines Teilchens schädlich gegenüber der Diffusion sein, da eine zu starke Matrixbindung das Ablösen von Partikeln von der ursprünglichen Bindungsstelle in der oberflächlichen Zone des Knorpels verhindert. Dies würde zu einer unzureichenden biologischen Reaktion führen, da die Meisten Der Zielstellen tief im Gewebe liegen11.
Um die Stärke der Bindungswechselwirkungen weiter zu quantifizieren, ist die Analyse der Wirkstoffdiffusionsraten durch Knorpel von Vorteil. Nicht-Gleichgewichtsdiffusionsstudien ermöglichen den Vergleich von Echtzeitdiffusionsraten zwischen verschiedenen Gelösten. Da Medikamente durch die oberflächlichen, mittleren und tiefen Zonen des Knorpels diffundieren, kann das Vorhandensein von Bindungswechselwirkungen die Diffusionsraten stark verändern. Wenn Bindungswechselwirkungen zwischen Medikamenten und der Knorpelmatrix vorhanden sind, wird sie als effektive Diffusivität (DEFF) definiert. In diesem Fall wird, sobald alle Bindungsstellen belegt sind, die Diffusionsrate von Medikamenten durch die stationäre Diffusion (DSS)bestimmt. Der Vergleich zwischen dem DEFF verschiedener Gelöster bestimmt die relative Bindungsfestigkeit von Gelösten mit der Matrix. Wenn sich die DEFF und DSS innerhalb derselben Größenordnung befinden, bedeutet dies für einen bestimmten Solute, dass es eine minimale Bindung zwischen dem Medikament und der Matrix während der Diffusion gibt. Wenn DEFF jedoch größer als DSSist, besteht eine wesentliche Bindung von Partikeln an die Matrix.
Die konzipierten Experimente ermöglichen individuell die Charakterisierung des gelösten Transports durch den Knorpel, jedoch ist eine ganzheitliche Analyse aller Ergebnisse erforderlich, um einen optimal aufgeladenen Drogenträger zu konstruieren. Die schwache und reversible Natur von Ladungswechselwirkungen steuert die Partikeldiffusionsrate und ermöglicht eine hohe Gleichgewichtsaufnahme und eine schnelle Volltiefe penetration durch Knorpel. Durch Gleichgewichtsaufnahmeexperimente sollten wir nach Trägern suchen, die eine hohe Aufnahme als Ergebnis von Ladungswechselwirkungen aufweisen, die mit Nicht-Gleichgewichtsdiffusionsratenstudien überprüft werden können. Diese Bindungswechselwirkungen sollten jedoch schwach und reversibel sein, um eine vollständige Dicke des Gelösten durch Knorpel zu ermöglichen. Ein idealer Arzneimittelträger würde eine optimale Ladung besitzen, die eine starke Bindung für die Aufnahme und hohe Intra-Knorpel-Medikamentenkonzentrationen ermöglicht, aber nicht zu stark, um die Volldicke diffusion zu behindern4. Die vorgestellten Experimente werden bei den Konstruktionsmerkmalen für ladungsbasierte Gewebe-Targeting-Medikamenteträger helfen. Diese Protokolle wurden zur Charakterisierung des CPC-Transports durch Knorpel4verwendet, können jedoch auch auf eine Vielzahl von Medikamenten und Drogenträgern durch Knorpel und andere negativ geladene Gewebe angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen Methoden und Protokolle sind für den Bereich der gezielten Medikamentenabgabe an negativ geladene Gewebe von Bedeutung. Aufgrund der hohen Dichte negativ geladener Aggrekane, die in diesen Geweben vorhanden sind, wird eine Barriere geschaffen, die verhindert, dass Medikamente ihre zellulären Zielstellen erreichen, die tief in der Matrix liegen. Um dieser noch offenen Herausforderung zu begegnen, können Medikamente modifiziert werden, um positiv geladene Drogenträger zu integrieren, die die Tran…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom US-Verteidigungsministerium durch die Congressionally Directed Medical Research Programs (CDMRP) unter Vertrag W81XWH-17-1-0085 und das National Institute of Health R03 EB025903-1 finanziert. AV wurde vom College of Engineering Dean es Fellowship an der Northeastern University finanziert.
Materials
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18×18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7×2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
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