Summary
Vi etablerade villkoren för att odla neurala stamceller från subventricular zonen och dentate gyrus av den vuxna hjärnan av präriesorkar, som en kompletterande in vitro-studie, att analysera de könsberoende skillnaderna mellan neurogena nischer som skulle kunna vara en del av funktionella plast förändringar i samband med sociala beteenden.
Abstract
Neurosfärer är primära cellaggregat som omfattar neurala stamceller och stamceller. Dessa 3D-strukturer är ett utmärkt verktyg för att bestämma differentiering och spridning potential neurala stamceller, samt att generera cellinjer än vad som kan analyseras över tiden. Också, neurospheres kan skapa en nisch (in vitro) som gör att modellering av den dynamiska föränderliga miljön, såsom varierande tillväxtfaktorer, hormoner, signalsubstanser, bland annat. Microtus ochrogaster (präriesork) är en unik modell för att förstå den neurobiologiska grunden för socio-sexuella beteenden och social kognition. Men de cellulära mekanismer som är inblandade i dessa beteenden är inte väl kända. Protokollet syftar till att få neurala stamceller från de neurogena nischerna hos den vuxna präriensork, som odlas under icke-vidhäftande tillstånd, för att generera neurosfärer. Storleken och antalet neurosfärer beror på regionen (subventricular zon eller dentate gyrus) och kön av prärien sork. Denna metod är ett anmärkningsvärt verktyg för att studera könsberoende skillnader i neurogena nischer in vitro och de neuroplasticitetsförändringar som är associerade med sociala beteenden som parbindning och biparental vård. Också, kognitiva tillstånd som medför underskott i sociala interaktioner (autismspektrumstörningar och schizofreni) skulle kunna undersökas.
Introduction
Präriesork (Microtus ochrogaster), en medlem av familjen Cricetidae, är ett litet däggdjur vars livsstrategi utvecklas som en socialt monogam och mycket sällskaplig art. Både hanar och honor etablera en varaktig par band efter parning eller långa perioder av samlevnad kännetecknas av att dela boet, försvara sitt territorium, och visar biparental vård för sin avkomma1,2,3,4. Således är prärien sork en värdefull modell för att förstå den neurobiologiska grunden för socio-sexuellt beteende och funktionsnedsättningar i social kognition5.
Vuxen neurogenes är en av de mest paramount bearbetar av neural plasticity som leder till beteendeförändringar. Till exempel rapporterade vår forskargrupp i manliga sorkar att social samlevnad med parning ökad cellproliferation i subventricular zonen (VZ) och subgranular zon i dentate gyrus (DG) av hippocampus, vilket tyder på att vuxna neurogenes kan spela en roll i bildandet av par bindning framkallas genom parning i präriesorkar (opublicerade data). Å andra sidan, även om hjärnan regioner där nya nervceller genereras och integreras är väl kända, de molekylära och cellulära mekanismer som deltar i dessa processer förblir obestämd på grund av tekniska nackdelar i hela hjärnan modell6. Till exempel, signalvägarna som styr genuttryck och andra cellulära aktiviteter har en relativt kort aktiveringsperiod (detektion av fosphoproteome)7. En alternativ modell är isolerade och odlade vuxna neurala stamceller eller stamceller för att klarlägga molekylära komponenter som är involverade i vuxna neurogenes.
Den första metoden för att upprätthålla in vitro neurala prekursorer från vuxna däggdjur (mus) hjärnan var analysen av neurosfärer, som är cellulära aggregat växer under icke-anhängare villkor som bevarar deras multipotenta potential att generera nervceller, samt astrocyter8,9,10. Under deras utveckling finns det en urvalsprocess där endast prekursorerna kommer att svara på mitogener som Epidermal Growth Factor (EGF) och Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) för att föröka och generera neurosfärer8,9,10.
Vår kunskap, är inget protokoll rapporteras i litteraturen för att erhålla vuxna neurala stamceller från prärien sorkar. Här etablerade vi kultur villkor för att isolera neuronal progenitors från neurogenic nischer och deras in vitro-underhåll genom neurosfären bildandet assay. Således kan experiment utformas för att identifiera de molekylära och cellulära mekanismer som är involverade i proliferation, migration, differentiering och överlevnad av de neurala stamceller och progenitors, processer som fortfarande är okända i prärien sork. Dessutom kan belysa in vitro-skillnader i egenskaperna hos de celler som härrör från VZ och GD ge information om den roll som neurogena nischer i neural plasticitet i samband med förändringar i socio-sexuellt beteende och kognitiva beteenden, och underskott i sociala interaktioner (autismspektrumstörning och schizofreni), som också kan vara sexberoende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien har godkänts av forskningsetiska kommittén vid Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexiko och Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). Djurens reproduktion, vård och humana effektmått fastställdes efter den officiella mexikanska standarden (NOM-062-Z00-1999) baserat på "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (Allmän hälsolag för hälsoforskning) i den mexikanska Hälsohemligheten.
1. Lösningar och lager förberedelser
- Förbered en N2 kultur medium med 485 mL av Dulbecco's Modified Eagle Medium-F12 (DMEM-F12), 5 mL av N2 tillägg (100x), 5 mL av glutamin tillägg (100x) och 5 mL av antibiotika-antimykotiska (100x).
- Förbered en B27 kultur medium med 480 mL av Neurobasal medium, 10 mL av B27 tillägg (50x), 5 mL av glutamin tillägg, och 5 mL av antibiotika-antimykotiska (100x).
- Rekonstruerat kollagenaspulver i 1x PBS (Fosfatbuffrad saltlösning) för att erhålla alikvoter med en aktivitet på 100 enheter/μL (1000x) och förvara vid -20 °C. Meddelande, kollagenas aktivitet beror på partinummer av företagen.
- Förbered dispase stock alikvoter genom att lösa upp 5 mg dispaspulver i 1x PBS (50 mg/mL). Förvaras vid -20 °C.
- Bered en enzymatisk lösning med 100 mL DMEM-F12 medium, 50 μL av lager kollagenas (100 enheter/μL) för att ha en slutlig koncentration på 50 U/mL och 333 μL lager dispase (50 mg/mL) för att ha en slutlig koncentration av 0,33 mg/mL.
- För att förbereda en tvättlösning, till 1 000 mL av 1x PBS, tillsätt 0,4766 g HEPES (slutkoncentration 2 mM), 3,6 g D- glukos (slutkoncentration 20 mM) och 2,1 g NaHCO3 (slutkoncentration 25 mM).
- Förbered alikvoter av poly-L-ornitin (1 mg/mL) med hjälp av sterilt vatten och förvara vid -20 °C.
- Förbered en fungerande lösning av poly-L-ornitin. Späd en bestånds alikvot (1mg/mL) i 49 mL sterilt vatten för en slutkoncentration på 20 μg/mL.
- Förbered en fungerande lösning av laminin. Späd 25 μL laminin (1 mg/mL originalbuljong) i 5 mL sterilt vatten för en slutkoncentration på 5 μg/mL.
OBS: Efter beredning, filtrera kulturmedia, arbets- och lagerlösningar för att undvika kontaminering. Använd en spruta eller flask-top vakuumfilter (polyethersulfone membran med en 0,2 μm porstorlek). Kulturmedierna och arbetslösningarna kan lagras i upp till 30 dagar vid 4 °C, medan lagren kan lagras i upp till fyra månader vid -20 °C.
2. Förberedelser innan mikrosektionen påbörjas
- Sterilisera kirurgiska instrument genom autoklavering eller med en varm glaspärla torr sterilisator.
- Rengör mikrosektionsytan under stränga aseptiska och antiseptiska förhållanden (t.ex. med ozoniserat vatten).
OBS: Tidpunkten för mikrodissektion av båda neurogena nischer från varje sork hjärna är cirka 30 min. Att arbeta med 1-4 djur för hela proceduren rekommenderas.
3. Utvinning av hela hjärnan
- Bedöva den vuxna sorken (12-16 veckor) med en överdos av pentobarbital (6,3 mg/djur) genom intraperitoneal injektion. Verifiera anestesidjupet genom avsaknad av pedalreflex som svar på en fast tå nypa.
- När sorken är helt sövd, framkalla dödshjälp genom halshuggning och återvinna huvudet.
- Dissekera huden från skallen med sax, vilket gör en caudal-rostral snitt (15 mm lång) för att exponera skallen.
- Skär occipital och interparietal ben och spåra ett snitt i skallen längs sagittal och parietal suturer.
- Gör ett hål i skallen vid korsningen av främre och parietalben med hjälp av sax, vara mycket noga med att inte skada hjärnvävnaden.
- För att exponera hjärnan, ta bort de återstående kraniumfragment som täcker båda hjärnhalvorna med skarpsyst pincett.
- Använd en rostfri spatel för att lyfta hela hjärnan från kranialbasen.
- Samla upp hjärnan i ett centrifugrör (50 mL) med 20 mL kalltvättslösning.
- Tvätta hjärnan två gånger med kalltvättlösningen.
4. Mikrosektion av den neurala vävnaden
- Placera en petriskål på en yta omgiven av is.
- Deponera hjärnan på skålen och tillsätt 20 mL kalltvättlösning.
- Med en skalpell, i koronaplanet, dela upp hjärnan i två block av vävnad (rostral och caudal). Som neuroanatomisk referens, utför koronaskuren på Bregma-nivå i den främre-bakre axeln11 (Figur 1A, heldragen linje).
- Från rostralblocket, extrahera VZ vävnaden (Figur 1B), medan från caudalblocket ta bort GD (Bild 1C).
- Dissekera VZ under ett stereomikroskop.
- Med en Dumont-tövyps, håll en av halvkloten; sedan, sätt in, på höjden av ventrikeln, de fina spetsarna på en andra Dumont-forceps under vävnaden som linjer caudatus-putamen (Figur 2A).
- Öppna tången längs dorsoventralaxeln för att separera vävnaden.
- Samla upp VZ-vävnaden per individ i ett centrifugrör med 2 mL kalltvättlösning. Poola inte vävnaden hos mer än två djur.
- Upprepa mikrodissektionen i den andra hjärnhalvan.
- Förvara röret som innehåller den bilaterala VZ-vävnaden på is och fortsätt dissekera generaldirektoratet.
- Dissekera GD från caudalblocket under ett stereomikroskop.
- Med en skalpell, gör en koronal skuren i blocket för att få två skivor, där hippocampusformationen observeras. Som landmärke görs snittet vid -2 mm Bregma-koordinater i den främre-bakre axeln enligt mushjärnatlasen11 (Bild 1A, prickad linje och figur 1C).
- Med en Dumont-tcärkar, håll en av skivorna, och med fina-punkt Dumont-forceps gör ett horisontellt snitt mellan GD och CA1 och utför sedan ett vertikalt snitt mellan GD och CA3 för att separera GD (Figur 2B).
- Upprepa dissektionen i den första delen av den andra hjärnhalvan.
- Upprepa dissektionen i båda halvkloten i den andra segmentet.
- Samla de fyra DG bitar av varje sork i en centrifug röret. Poola inte GD vävnaden för fler än två djur.
OBS: Om dissektion av mer än ett djur krävs, förvara centrifugrören med VZ eller GD-vävnaden på is samtidigt som du fortsätter att dissekera resten av hjärnan. Ta bort alla blodkärl som täcker hjärnvävnaden medan dissekera. Om kärlen inte kasseras, kan kulturen blandas med ett överskott av erytrocyter och störa neurosfärbildning.
5. Isolering av neurala celler
- Placera centrifugrören inuti biosäkerhetsskåpet och vänta ca 10 min på att vävnadsfragmenten ska fällas ut av tyngdkraften.
- Ta bort tvättlösningen och tillsätt 1 mL av den varma enzymatiska lösningen till varje rör.
- Inkubera rören vid 37 °C i 10 min.
- Sönderfaller vävnadsfragmenten; pipetten uppåt och nedåt med en 1 mL-spets. Pipetten får inte vara mer än 30x.
- Utför en andra inkubation på 10 min vid 37 °C.
- I slutet av den andra inkubationen, pipetten att bryta upp vävnaderna. Pipetten får inte vara mer än 30x.
OBS: Efter pipettering bör vävnadsfragmenten vara helt sönderdelade; om de inte upplöses, inkubera i ytterligare 10 min vid 37 °C och återpipett. Rötningsperioden bör inte överstiga 30 min. - Tillsätt 9 mL N2 medium per rör för att späda ut den enzymatiska behandlingen.
- Centrifugera rören vid 200 x g i 4 min vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och tvätta med 10 mL N2 medium.
- Centrifugera under samma förhållanden som steg 5.8.
- Ta bort supernatanten från varje rör och återanvänd cellpelletsen i VZ respektive GD i 2 mL respektive 1 mL av B27-mediet.
- För att avlägsna eventuell icke-desintegrerad vävnad, filtrera varje cellulär suspension med hjälp av en cellsil (storlek 40 μm).
6. Neurosfärer bildande
- Odla cellerna passerade genom silen till en ultra-låg fastsättning, 24-brunnsplatta. Använd två brunnar för VZ och en brunn för GD (1 mL B27 medium/brunn).
- Tillsätt 20 ng/mL av FGF2 och 20 ng/mL av EGF till varje brunn (slutlig koncentration 1x).
- Inkubera vid 37 °C, 5 % CO2 och hög luftfuktighet (90-95%). Stör ej i 48 h (dag 1 och dag 2 av kultur, D1-D2).
- På den tredje dagen (D3), ta bort hälften av odlingsmediet och ersätta den med färskt B27 medium (500 μL per brunn) kompletterat med dubbel koncentration (2x) av tillväxtfaktorer.
- Upprepa var tredje dag, ändra odlingsmediet (hälften av det) och ersätt det med ett färskt B27-medium kompletterat med dubbel koncentration (2x) av tillväxtfaktorer.
- På dagar när det inte är nödvändigt att ändra odlingsmediet, lägg till tillväxtfaktorer till en slutlig koncentration av 1x.
- Se till att neurosfärerna bildas runt D8-D10.
- Vid D10, ändra komplett odlingsmedium för att ta bort allt skräp.
- Samla mediet och neurospheres individuellt av varje brunn i centrifugrör.
- Inkubera i 10 min i rumstemperatur. Detta förfarande tillåter neurosfärer nederbörd av gravitationen.
- Ta bort supernatanten och resuspend i 1 mL färskt B27 medium kompletterat med tillväxtfaktorer.
- Placera tillbaka neurosfärerna i samma ultralåg fästplatta och inkubera vid 37 °C, 5 % CO2.
- Från D10 till D15, fortsätta att ändra hälften av mediet och lägga till tillväxtfaktorer.
7. Passage av neurosfärerna
- Vid D15 av den primära kulturen, samla in neurosfärerna i centrifugrör med hjälp av 1 mL pipett. Skär pipettspetsen för att öka storleken på öppningen för att undvika skador på neurosfärerna.
- Inkubera i 10 min i rumstemperatur. Neurosfärer fällning av gravitationen.
- Ta bort mediet och tillsätt 1 mL av cellen lossnar medium per rör.
- Inkubera rören i 7 min vid 37 °C.
- Pipett upp och ner med en 1 mL spets för att demontera neurosfärerna.
- Späd cellavlossningsmediet med 3 mL B27 medium per rör.
- Centrifugera cellupphängningen i 5 min vid 200 x g.
- Kassera supernatant och resuspend varje cell pellet med en färsk B27 medium kompletteras med tillväxtfaktorer.
- Resuspend de VZ-härledda cellerna i 4 mL medium och de DG-härledda cellerna i 2 mL medium.
- Odla cellerna (passage 1) i en ny ultralåg fästplatta genom att fördubbla antalet brunnar som användes i primärkulturen (4 respektive 2 brunnar för VZ respektive GD).
- Byt hälften av mediet var tredje dag och lägg till tillväxtfaktorer dagligen.
- Efter 10 dagar (D10) i passage 1, ändra till vidhäftande förhållanden i nästa passage.
8. Passagen i vidhäftande förhållanden
- Innan passagen utförs 2, preparera belagda plattor med poly-L-ornitin och laminin.
- I 24-brunnsplattor, tillsätt 500 μL av 1x poly-L-ornitin (20 μg/mL) per brunn. Inkubera vid 37 °C över natten.
- Ta bort poly-L-ornitin och tvätta 4x med 1x PBS (500 μL/brunn).
- Tillsätt 200 μL (minsta volym för att täcka ytan på en enda brunn) på 1x laminin (5 μg/mL) per brunn och inkubera i 2-3 h vid 37 °C innan cellerna odlas.
- Samla in neurosfärerna med 1 mL pipetten med skuren spetsar i ett centrifugrör.
- Inkubera i 10 min vid rumstemperatur för att fälla ut neurosfärerna genom gravitation.
- Kassera supernatant och resuspend neurospheres i färska B27 medium utan tillväxtfaktorer.
- Aspirera lamininen från den belagda plattan och sätt in neurosfärerna i brunnarna med hjälp av 1 mL-pipetter med skärspetsar.
OBS: Förhindra att belagda brunnar torkar ut mellan lamininborttagning och plätering av neurosfärer. - Dela upp kulturen i två villkor:
- Underhåll differentierade neurosfärer i 6 dagar (D6). Ändra mediet var tredje dag och lägg till tillväxtfaktorer dagligen.
- Observera differentiering av de neurosfär-härledda cellerna med 12 dagar (D12). Ändra mediet var tredje dag utan tillväxtfaktorer.
OBS: I slutet av D6 för odifferentierade eller D12 för differentieringsförhållanden kan cellerna användas för konventionell immunohistokemi, cellsorteringsanalys, 5-Ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) färgning, RNA-extraktion, bland annat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neurospheres bildades från neurala stamceller isolerade från VZ och GD av både kvinnliga och manliga vuxna prärien sorkar. Omkring 8-10 dagar efter att ha startat kulturen, celler borde ha bildat neurosfärer. Observera att plattan kan innehålla skräp i primärkulturen (Bild 3A). Men i passage 1 bör kulturen endast bestå av neurosfärer (Figur 3B).
Ett högre antal neurosfärer erhölls från den kvinnliga VZ som jämfört med den manliga VZ och GD av både honor och hanar (Figur 4A). Dessa data tyder på att antalet neurospheres som erhållits beror på proliferative zonen och sork kön. När neurospheres dök upp (D8-D10), de bibehölls i ytterligare sju dagar i kultur, och deras tillväxt övervakades under denna period. Neurosfärernas diameter mättes på D8, D11, och D14 (Tabell 1 och Bild 4B). Neurosfärens storlek (diameter) ökade successivt enligt kulturdagarna för manliga och kvinnliga sorkar i båda neuronala regionerna. Neurospheres som härleddes från de manliga hjärnorna var mindre i jämförelse med de neurosfärer som härstammar från den kvinnliga hjärnan i båda neurogena områdena (Figur 4B).
Efter 15 dagar av primär kultur på flytande villkor, var neurospheres expanderade i passage 1 under samma villkor. För den efterföljande passagen 2 växte cellerna i självhäftande kultur, även om de kunde hålla sig sedan passage 1. Följne neurosfärer karakteriserades på dag sex (D6) i närvaro av tillväxtfaktorer (odifferentierat tillstånd, figur 5A) eller istället fram till dag 15 (D15) utan tillväxtfaktorer (differentierat tillstånd, figur 5B).
Vid D6 under odifferentiationsförhållanden uttryckte de neurosfärhärledda cellerna nestin (en markör för neurala progenitorer) (figur 6). Också, Det var möjligt att identifiera doublecortin (DCX) positiva celler (migrationsceller) och spridningsmarkören Ki67, som indikerar förekomsten av antingen neuronala prekursorer eller omogna nervceller. Men, avsaknaden av colocalization av Ki67 med DCX tyder på förekomsten av postmitotiska neuroblaster (Figur 7). Slutligen, vid D15 under differentieringsförhållanden, mogna nervceller (MAP2-positiva celler) hittades, liksom celler med den gliamofenotyp (GFAP-positiva celler), som visar differentiering potential av de isolerade cellerna (Figur 8).
Figur 1: Dorsal syn på en vuxen sork hjärna och dess neurogena regioner. (A) Den fasta linjen på Bregma nivå var den anatomiska referensen för att separera hjärnan i två block, rostral och caudal. Den streckade linjen var referensen för att dela upp caudalblocket för att få tag på två skivor som innehöll generaldirektoratet. (B) Koronal syn på de neuronala regioner som exponeras med det första snittet, där VZ är belägen. (C) Koronal syn på de anatomiska regioner som exponeras med det andra snittet, där generaldirektoratet är beläget. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Anatomiska referenser för dissektion av neurogena regioner. (A) Schema och fotografi av koronasektionen från rostralblocket som visar VZ-platsen (prickad linje). (B) Schema och fotografi av koronasektionen från det caudalblock som visar GD-dissektionen. CPu, caudate putamen; V, ventrikel; VZ, ventrikulär zon, GD, dentate gyrus; CA1 och CA3, regioner i hippocampus. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa mikrografer av neurospheres kultur som härrör från neurogena nischer av den vuxna prärien sork. (A) Primär kultur av neurosfärer isolerade från VZ av kvinnliga sorkar vid D10. (B) Passage 1 av neurosfärer som härrör från VZ av kvinnliga sorkar vid D10. Skala barer = 200 μm. n= 3 för varje neurogen region och kön av sorken. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Antalet och storleken på neurosfärer var beroende av både kön och neurogen källa. (A) Antalet neurosfärer i primärkultur som erhållits från VZ och GD i både kvinnliga och manliga sorkar vid D10. Data analyserades med en enkelriktad ANOVA följt av en Tukey's post hoc-tester. Betydande skillnader hittades mellan den kvinnliga VZ och resten av grupperna, *** p <0,001. (B) Diametern av neurosfärerna i hela D8-D14 i primärkulturen berodde på sork kön. Data analyserades med en tvåvägs ANOVA följt av Tukey's post hoc-tester. Jämförelser inom gruppen (skillnader inom samma grupp) visade en ökning av neurosfärstorleken mellan D8 jämfört med D11 och D14, (*p<0,05, ***p<0,001, ****p<0,0001); och D11 vs D14 (+++ p<0.001) i VZ och GD av kvinnliga och manliga sorkar. Jämförelse mellan grupper (skillnader mellan grupper i samma region) visade att kvinnliga VZ och GD neurosfärer är större än manliga neurosfärer vid D11 och D14. ### p<0.0001. VZ erhölls från hanar och honsorkar (n=3, per grupp). 15 kvinnliga och 10 manliga neurospheres analyserades. GD erhölls från hanar och honsorkar (n=3, per grupp). 8 kvinnliga neurospheres och 5 manliga neurospheres bearbetades. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Representativa bilder av neurosfärer som härrör från den kvinnliga VZ odlade i vidhäftningsförhållanden i passage 2. (A) Neurosfärer som följs i passage 2 med tillväxtfaktorer vid D2. (B) Neurosfär-härledda celler som följs i passage 2 utan tillväxtfaktorer vid D10. Skala bar = 200 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Uttryck för nestin i neurosfärer. Representativa, epifluorescens-mikroskopi bilder av nestin-positiva celler som härrör från VZ av både kvinnliga och manliga vuxna hjärnor på odifferentierade stadium. Skala barer = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Uttryck för DCX och Ki67 i neurosfärer. Representativa epifluorescens-mikroskopi bilder av DCX-, Ki67-positiva celler och sammanstrålande härrör från VZ av både vuxna kvinnliga och manliga hjärnor på odifferentierade stadium. Skala barer = 25 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 8: Uttryck för MAP2 och GFAP i neurosfärer. Representativa, epifluorescens-mikroskopi bilder av MAP2 (mogna nervceller) och GFAP (gliaceller) positiva celler som härrör från VZ av både vuxna kvinnliga och manliga hjärnor på differentierade stadium. Skala barer = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Storlek på neurosfärer (μm) | |||||
| Vz | Gd | ||||
| Kulturdagar | Sex | Medelvärde ± SD | Kulturdagar | Sex | Medelvärde ± SD |
| D8 | F | 102.1±18,2 | D8 | F | 55,3±8,5 |
| M | 86,5 ±15,1 | M | 37,6±6,8 | ||
| D11 | F | 217,3±35,7 | D11 | F | 142,1 ±15,4 |
| M | 158,9±47,2 | M | 71,8 ±14,4 | ||
| D14 | F | 306,6 ±44,4 | D14 | F | 243,8 ±37,4 |
| M | 210,8 ±42,3 | M | 120.2±19,1 | ||
Tabell 1: Kvantifiering av den genomsnittliga storleken (diametern) av neurosfärer som isolerats från neurogena nischer i primärkulturen. Väsentliga skillnader visas i diagram 4. VZ erhölls från hanar och honsorkar (n=3, per grupp). Femton neurospheres från honor och tio från män analyserades. GD erhölls från hanar och honsorkar (n=3, per grupp). Åtta kvinnliga neurospheres och fem manliga neurospheres bearbetades.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett stadium för att få en neural stamcellskultur är matsmältningsperioden med den enzymatiska lösningen, som inte bör överstiga mer än 30 min eftersom det kan minska cellens livskraft. Neurosfärerna bör dyka upp vid 8-10 dagar efter den inledande kulturen; om de inte dyker upp dag 12, kasserar du kulturen och upprepar experimentet, vilket minskar rötningsperioden. En annan fråga är blodkärlen som täcker hjärnvävnaden. De bör avlägsnas helt under dissekering eftersom överskottet av erytrocyter kan störa neurosfärerna bildandet.
Detta protokoll tillåter expanderande den flytande neurosfärer tills passage 2 och ändra till anhängare villkor att utvärdera de neurosfär-härledda cellerna. Det har dock begränsningar såsom en minskning av den neurogena potentialen, som växlar till gliogenic differentiering vid successiva passager som en anpassning svar på in vitro-villkor12. Av denna anledning rekommenderade vi karakterisera neurosfärerna i den primära kulturen och passage 1, och fortsätta med nästa passage endast om det krävs för att expandera cellerna för experiment som inte innebär att belysa skillnader på grund av ursprunget.
Intressant nog kan inneboende skillnader hittas i den primära kulturen av neurosfärer som ett resultat av den neuroanatomiska (VZ eller GD) eller kön-beroende (kvinnor eller hanar) källa. Sålunda är antalet och diametern av neurospheres som härrör från båda neurogena regioner av honor högre i jämförelse med män. Detta kan vara en funktionell skillnad i den kvinnliga hjärnan nisch jämfört med den hos män, vilka molekylära mekanismer kan studeras in vitro med denna analys.
Cellkultur av neurosfärer som härrör från den vuxna hjärnan sork är ett värdefullt verktyg som kan bidra till att lösa avvikelser mellan studier in vivo. Till exempel, Fowler och medarbetare rapporterade att social isolering för 48 h inducerar en ökning av 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)-positiva celler i VZ, utan att påverka GD6. Däremot Lieberwirth et al.; påvisat en minskning av cellproliferationen iGD 13. Vidare kan in vitro-kulturen vara en modell för utvärdering av de molekylära mekanismerna i neurogena regioner som skulle kunna förknippas med beteendeförändringar i en social modell som präriesork. Till exempel har det föreslagits att exponering för nyfödda inducerar, i både icke-föräldra- och föräldrasorkar, en ökning av BrdU- positiva celler iGD 14. Resultaten av denna studie kan bekräftas med hjälp av vår cell kultur protokoll med BrdU märkning. Men även om de flesta studier på sorkar och andra däggdjur använder BrdU märkning för att identifiera nya celler, en nackdel är att labbeling kan förändras beroende på de injiceradedoserna 15. EdU, en annan tymidin analog, är ett idealiskt alternativ för att identifiera celler under cellcykelfasen in vitro-kulturer. I samma experiment är det möjligt att ha flera perioder för införlivandet av EdU, och till skillnad från BrdU är DNA-denaturering eller inkubation med antikroppar det inte nödvändigt för dess upptäckt. Även EdU-positiva celler kan bedömas för samlokalisering med markörer för att identifiera celldelningscykeln (Ki67) och bestämma deras fenotyp med hjälp av markörer av neurala stamceller eller stamfader (Nestin, Sox2 och Pax6).
Neurosfärerna kulturen kan fastställas som en modell för att studera effekten av hormoner, små molekyler eller läkemedel i spridningshastigheten, neurogenes och epigenetiska modifieringar i de neurala stamceller och progenitorer av präriesorkar. Till exempel, tidigare studier har föreslagit rollen av stresshormoner (som kortikosteron) och östrogener i regleringen av vuxna neurogenes i prärien sorkar, men de underliggande regleringsmekanismer är okända6.
Slutligen, autismspektrumstörningar (ASD) och schizofreni (SZ) är relaterade till nedskrivningar i social kognition16,17. Intressant, oxytocin och arginin-vasopressin har en grundläggande roll i sociala och känslomässiga beteende, och genen uttryck variationer i deras receptorer (OXTR och vasopressin 1a (V1AR), respektive) är förknippade med både ASD och SZ18,19,20,21. Dessutom är förändring i neurogenes och neural migration under neuroutveckling inblandade i physiopathology av dessa beteendestörningar22,23,24. Således föreslår vi att analysera de molekylära mekanismerna medieras av dessa hormoner på neurogenes, neural migration och andra cellulära händelser vars förändringar är relaterade till neurologiska sjukdomar med hjälp av präriesork cell kultur in vitro modell på grund OXTR och V1AR receptorer finns i prärien sork hippocampus25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av bidrag CONACYT 252756 och 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 och IN203518; INPER 2018-1-163, och NIH P51OD11132. Vi tackar Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris och Susana Castro för deras utmärkta tekniska bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, Pt 1 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
