Plasmodium falciparum Culture de gamétocytes et infection par les moustiques par l’alimentation par membrane artificielle

Summary

Des études détaillées sur les stades des moustiques des parasites du paludisme sont essentielles pour concevoir des stratégies efficaces de blocage de la transmission. Ce protocole montre comment mettre en culture efficacement des gamétocytes infectieux, puis nourrir ces gamétocytes avec des moustiques pour générer des stades de moustiques de P. falciparum.

Abstract

Le paludisme reste l’un des problèmes de santé publique les plus importants, causant une morbidité et une mortalité importantes. Le paludisme est une maladie transmise par les moustiques transmise par une piqûre infectieuse du moustique anophèle femelle. La lutte contre le paludisme reposera éventuellement sur une multitude d’approches, notamment des moyens de bloquer la transmission vers, par et depuis les moustiques. Pour étudier les stades des moustiques des parasites du paludisme en laboratoire, nous avons optimisé un protocole de culture de gamétocytes hautement infectieux de Plasmodium falciparum, un stade parasitaire nécessaire à la transmission de l’hôte humain au moustique vecteur. Les gamétocytes de P. falciparum mûrissent à travers cinq étapes morphologiquement distinctes, ce qui prend environ 1 à 2 semaines. La culture de gamétocytes décrite dans ce protocole est terminée en 15 jours et est infectieuse pour les moustiques des jours 15 à 18. Ces protocoles ont été développés pour maintenir un cycle continu de gamétocytes compétents en matière d’infection et pour maintenir un approvisionnement ininterrompu des stades de moustiques du parasite. Ici, nous décrivons la méthodologie de culture de gamétocytes et comment infecter les moustiques avec ces parasites en utilisant des mangeoires à membrane de verre.

Introduction

Le paludisme est causé par les parasites Plasmodium et est transmis à leurs hôtes vertébrés par la piqûre infectieuse de moustiques anophèles femelles. Selon le rapport 2019 de l’Organisation mondiale de la santé (OMS), on estime à 405 000 le nombre de décès, sur un total de 228 millions de cas de paludisme^1. La plupart des décès liés au paludisme étaient concentrés dans la région africaine, en particulier chez les enfants de moins de cinq ans. Alors que le taux d’incidence global du paludisme a diminué à l’échelle mondiale à partir de 2010, le déclin a plafonné ces dernières années et des stratégies de lutte supplémentaires sont nécessaires de toute urgence pour éliminer la maladie.

Les stades sanguins asexués cycliques des parasites du paludisme provoquent une pathogenèse de la maladie et un petit sous-ensemble de ceux-ci se différencient en gamétocytes femelles et mâles. Les gamétocytes de Plasmodium falciparum sont uniques par nature car ils prennent de 7 à 10 jours à se développer à travers cinq stades morphologiquement distincts. Les gamétocytes immatures du stade I à IV sont séquestrés dans le parenchyme de la moelle osseuse et restent largement absents de la circulation périphérique^2,3,4,5. Les érythrocytes infectés par des gamétocytes matures de stade V sont libérés dans la circulation sanguine et circulent librement pour être pris par les moustiques. Une fois à l’intérieur de l’intestin moyen du moustique, les gamétocytes sont activés, par un changement de température et une exposition à l’environnement de l’intestin moyen, se transforment en gamètes femelles et mâles et commencent le développement des stades de moustique, qui culmine avec les stades infectieux des sporozoïtes dans les glandes salivaires des moustiques^6,7.

Depuis que Trager et Jenson⁸ ont décrit une méthode standardisée de culture de P. falciparum,les études sur les stades sanguins asexués ont considérablement progressé. Cependant, l’absence d’un système de culture fiable pour les stades sexuels a rendu difficile l’étude des gamétocytes de P. falciparum, de la biologie de la transmission et des stades des moustiques. Ces dernières années, plusieurs méthodes ont été publiées qui ont aidé les laboratoires à établir des cultures de gamétocytes^9,10,11,12. Ce manuscrit décrit un protocole normalisé et fiable pour la culture des gamétocytes de P. falciparum qui peut représenter une ressource précieuse pour la communauté de recherche sur le paludisme. Cette méthode permet la production robuste de gamétocytes matures et infectieux qui, avec un protocole d’alimentation normalisé des moustiques, se traduit par une infectiosité très fiable des moustiques. Ces méthodes ont été établies pour maintenir un approvisionnement ininterrompu en gamétocytes et en parasites au stade des moustiques. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole complet de culture de gamétocytes (Figure 1), la préparation de mangeoires à membrane de verre et l’infection des moustiques à l’aide de ces mangeoires membranaires (Figure 2), la dissection de l’intestin moyen (Figure 3) et de la glande salivaire des moustiques (Figure 4), et la quantification de l’infection chez les moustiques après la dissection de l’intestin moyen et des glandes salivaires.

Protocol

Les prélèvements sanguins décrits ci-dessous ont été approuvés par le Comité d’examen institutionnel de l’Université Johns Hopkins. P. falciparum est cultivé dans des globules biologiques frais dans des conditions stériles dans une installation de niveau de biosécurité 2 (BSL2) et la prudence est utilisée pour manipuler le matériel biologique. Après chaque étape impliquant du sang ou des produits sanguins, chaque plastique ou verrerie est rincée avec 10% d’eau de Javel dans la hotte avant …

Representative Results

Nous présentons ici les résultats d’une série d’alimentations membranaires utilisant des cultures de gamétocytes P. falciparum NF54 générées à l’aide du protocole ci-dessus (voir (Figure 5). La culture de gamétocytes a été initiée avec environ 0,5% de culture asexuée au stade mixte le jour 0, qui a atteint un pic de parasitémie d’environ 15% au jour 4 et au jour 5. Comme le montre la figure 5A à cette parasitémie élevée, les pa…

Discussion

Les méthodes décrites ici ont été utilisées avec succès à l’Institut de recherche sur le paludisme Johns Hopkins depuis plus de¹⁰ans^15,16,^17,18^,19,20,21,22. Les gamétocytes produits à l’aide de ce protocole ont été utilisés pour des tests ga…

Materials

10% Sugar solution
10ml serological pipet	Falcon	357551
15 ml conical tube	Falcon	352096
1ml serological pipet	Falcon	357521
25 ml serological pipet	Falcon	357535
37°C Incubator
50 ml conical tube	Falcon	352070
5ml serological pipet	Falcon	357543
6 well tissue culture plates	Falcon	353046
70% Ethanol
9" glass pipet	Fisherbrand	13-678-6B
Anopheles Mosquitoes	JHMRI, Insectary core		We use A. stephensi or A. gambiae (keele)
cell counter
Circulating water bath
fine tip forceps	Fisherbrand	12-000-122
Geimsa stain	Sigma	GS1L
Glass desiccator
Glass membrane feeder	Chemglass Life Sciences	CG183570
Glass slides	Fisherbrand	12-552-3
HBSS	Sigma	H6648
Human Blood O+	JHU		Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit
Human Serum O+	Interstate blood bank		Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C.
Hypoxanthine	Sigma	H9337	Make 500x stock in 1M NaOH
Mercurochrome	Sigma	M7011	Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed
Micro Pipette
Microscope	Olympus		Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work.
Mosquito cups	Neptune cups
N-acetylglucosamine	Sigma	A3286	Optional and needed only when pure gametocytes are required.
Netting			Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding
Parafilm
PBS
Petri dish	Thermo Scientific	249964
Pipet tips
Pipetman
Plasmodium falciparum NF54	BEI Resources	MRA-1000	Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply
RPMI 1640	Corning	CV-041-CV	Media contains glutamine and HEPES
Slide warmer
Sodium bicarbonate	Sigma	S6297	Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation
water bath
Xanthurenic Acid	Sigma	D120804	For flagellation media