플라스모듐 팔시파룸 인공 막 수유를 통한 게임토세포 배양 및 모기 감염
Summary
말라리아 기생충의 모기 단계에 대한 상세한 조사는 효과적인 전송 차단 전략을 설계하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 전염성 있는 게임토세포를 효과적으로 배양한 다음 이러한 게임토세포에 먹이를 주어 P. falciparum의모기 단계를 생성하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
말라리아는 중요한 이환율과 사망을 일으키는 원인이 되는 가장 중요한 공중 위생 문제 의 한개 남아 있습니다. 말라리아는 여성 Anopheles 모기에서 전염되는 바이트를 통해 전염되는 모기 매개 질병입니다. 말라리아 통제는 결국 모기를 통해 그리고 투과를 막는 쪽을 포함하는 접근의 다수에 의지할 것입니다. 실험실에서 말라리아 기생충의 모기 단계를 연구하기 위하여는, 우리는 모기 벡터에 인간 호스트에서 전송을 위해 요구되는 기생충 단계인 전염성이 높은 Plasmodium falciparum 게임토사이클을 배양하기 위하여 프로토콜을 최적화했습니다. P. falciparum 게임토세포는 약 1-2주가 걸리는 5개의 형태학적으로 뚜렷한 단계를 통해 성숙합니다. 이 프로토콜에 기재된 게임토세포 배양은 15일 이내에 완료되며 15-18일부터 모기에 감염된다. 이러한 프로토콜은 감염 유능한 게임토세포의 지속적인 주기를 유지하고 기생충의 모기 단계의 중단없는 공급을 유지하기 위해 개발되었다. 여기에서는 게임토세포 배양의 방법론과 유리 막 피더를 사용하여 이러한 기생충으로 모기를 감염시키는 방법을 설명합니다.
Introduction
말라리아는 플라스모듐 기생충에 기인하고 여성 아노페Les 모기의 전염성 바이트를 통해 그들의 척추 동물 호스트에게 전달됩니다. 2019년 세계보건기구(WHO) 보고서에 따르면 총 2억 2,800만 건의 말라리아1건에서약 405,000명의 사망자가 발생했다. 말라리아 관련 죽음의 대부분은 아프리카 지역에 집중되었습니다, 특히 5 세 이하의 아이들 중. 말라리아의 전반적인 부각 비율은 2010년부터 전 세계적으로 감소하는 동안, 최근 몇 년 동안 쇠퇴는 고원하고 추가 통제 전략은 질병을 제거하기 위하여 긴급하게 필요합니다.
말라리아 기생충의 순환 무성 혈액 단계는 질병 병인을 일으키는 원인이 되고 이들의 작은 부분 집합은 여성과 남성 게임토세포로 분화합니다. 플라스모듐 falciparum 게임 토세포는 5 개의 형태학적으로 뚜렷한 단계를 통해 개발하는 데 7-10 일이 걸리기 때문에 자연에서 독특합니다. 단계 I에서 IV까지미성숙한 게임토세포는 골수 parenchyma에서 격리되고 주로 말초 순환2,3,4,5에서결석남아 있습니다. 성숙한 단계 V 게임토세포에 감염된 적혈구는 혈류량에 방출되고 모기에 의해 채택되기 위하여 자유롭게 순환합니다. 일단 모기 미드구트 안에, 게임토세포는 미드구트 환경에 온도 및 노출의 변화를 통해 활성화되고, 여성과 남성 게임으로 변환하고 모기 단계의 발달을 시작, 이는 모기 타액선지6에서 산발성 의 감염 단계로절정6,7.
트레이거와 젠슨8이 P. falciparum배양에 표준화된 방법을 설명했기 때문에 무성혈액 단계에 대한 연구가 크게 진행되었습니다. 그러나, 성적 단계에 대한 신뢰할 수있는 문화 시스템의 부족은 P. falciparum 게임 토세포, 전염 생물학 및 모기 단계를 연구하기 어렵게 만들었습니다. 최근에는 게임토사이클 문화 9,10,11,12를설정하는실험실을도왔던 여러 가지 방법이 발표되었습니다. 이 원고는 말라리아 연구 커뮤니티에 귀중한 자원을 나타낼 수있는 문화 P. falciparum 게임 토세포에 표준화되고 신뢰할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 표준화 된 모기 먹이 프로토콜과 함께 매우 신뢰할 수있는 모기 감염성을 초래하는 성숙하고 전염성 있는 게임토세포의 견고한 생산을 가능하게합니다. 이러한 방법은 게임토세포와 모기 단계 기생충의 끊임없는 공급을 유지하기 위해 설립되었다. 본 원고에서는 철저한 게임토세포 배양프로토콜(도 1),유리막 피더의 준비 및 모기의 감염(도2),미드구트의해부(도 3)및 모기의 타액선(도 4)및 중구 및 타액 선해부 후 모기감염의 정량화를 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 방법은 10년 이상 존스 홉킨스 말라리아 연구소에서 10년 이상15년,16년,17년,18년,19,20,21,22이상에성공적으로 사용되어 왔다. 이 프로토콜을 사용하여 생산된 게임토세포는 높은 처리…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 존스 홉킨스 말라리아 연구소 (JHMRI)에 재정 지원을 블룸버그 자선 사업가에게 감사드립니다. 이 작품은 JHMRI 곤충 및 기생충학 핵심 시설에서 제공하는 전문 지식없이는 가능하지 않았을 것입니다.
Materials
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
Riferimenti
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