איתור דנ"א ללא תאים בדגימות פלזמה בדם של חולי סרטן

Summary

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור טכניקת ביופסיה נוזלית לא פולשנית, כולל איסוף דם, פלזמה והפרדת מעיל באפי, cfDNA ומיצוי DNA נבט, כימות של CFDNA או DNA נבט, וניתוח העשרת שבר cfDNA.

Abstract

זיהוי מוטציות בגידולים של חולי סרטן הוא צעד חשוב מאוד בניהול מחלות. מוטציות אלה משמשות סמנים ביולוגיים לאבחון הגידול, כמו גם לבחירת הטיפול ותגובתו בחולי סרטן. השיטה הנוכחית של תקן הזהב לגילוי מוטציות בגידול כרוכה בבדיקה גנטית של דנ”א גידולי באמצעות ביופסיות גידול. עם זאת, שיטה פולשנית זו קשה להתבצע שוב ושוב כבדיקת מעקב של רפרטואר מוטציה הגידול. ביופסיה נוזלית היא טכניקה חדשה ומתפתחת לגילוי מוטציות בגידולים כגישה ביופסיה קלה לשימוש ולא פולשנית.

תאים סרטניים מתרבים במהירות. במקביל, תאים סרטניים רבים עוברים אפופטוזיס. פסולת מתאים אלה משתחררים לתוך מערכת הדם של המטופל, יחד עם חתיכות DNA מקוטע דק, הנקרא DNA ללא תאים (cfDNA) שברים, אשר נושאים מוטציות DNA הגידול. לכן, לזיהוי סמנים ביולוגיים מבוססי cfDNA באמצעות טכניקת ביופסיה נוזלית, דגימות דם נאספות מחולי הסרטן, ואחריו הפרדת פלזמה ומעיל באפי. לאחר מכן, פלזמה מעובדת לבידוד של cfDNA, ואת מעיל באפי בהתאמה מעובד לבידוד של ה-DNA הגנומי של המטופל. שתי דגימות חומצת גרעין נבדקות לאחר מכן עבור כמות ואיכותן; ונותחו עבור מוטציות באמצעות טכניקות רצף הדור הבא (NGS).

בכתב יד זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביופסיה נוזלית, כולל איסוף דם, פלזמה והפרדת מעיל באפי, הפקת דנ”א cfDNA ונבט, כימות של CFDNA או DNA נבט, וניתוח העשרת שבר cfDNA.

Introduction

ההתקדמות הטכנולוגית הובילה לריצוף של מאות גנומים וסרטן ותעתיקים¹. זה תרם להבנת נופים של שינויים מולקולריים על פני סוגי סרטן שונים². מחקרים נוספים על נופים אלה סייעו לאפיין את השינויים הסומטיים הרציפים והיתוך^{גנים-גנים 3} המעורבים בהתקדמות סרטן או גידול, על ידי שיבוש סדרתי של מסלולי אפופטוזיס⁴. לכן, מוטציות סומטיות והיתוך גנים-גנים יכולים לספק מידע על גידולים על ידי לשמש סמנים ביולוגיים בחולים בודדים עבור סוג גידול מסוים⁵, זיהוי גידולים ראשוניים קיימים פרוגנוזה⁶, סיווג גידולים משניים המבוססים על שינויים מולקולריים⁷, וזיהוי מטרות גידול תרופתי⁸. מידע כזה עשוי להקל בבחירת טיפול מותאם אישית לחולי סרטן ובקביעת תגובות טיפול חיוביות ושליליות⁹. עם זאת, קבלת חומר הגידול לזיהוי פרופיל גנומי של רקמת הגידול הוא הליך פולשני¹⁰. יתר על כן, ביופסיה גידול מורכב רק חלק קטן של גידול הטרוגניים; ולכן, לא להיות מייצג את הפרופיל המולקולרי של הגידול כולו¹¹. ניטור סדרתי ו genotyping הגידול דורשים אוסף חוזר ונשנה של רקמות הגידול, אשר, בדרך כלל, אינו ריאלי בשל פולשנות של הליך ביופסיה הגידול ואת בעיות הבטיחות הנובעות הליכים כאלה¹².

טכניקת הביופסיה הנוזלית, לעומת זאת, צברה תשומת לב עצומה באונקולוגיה מדויקת בעשור האחרון^13,14. זה בעיקר בשל אי פולשניות של טכניקה זו, ואת האפשרות של זה חוזר על עצמו בנקודות זמן מרובות, ובכך מאפשר טכניקה קלה לשימוש ניטור בטוח עבור קורסי המחלה^15,16. ביופסיה נוזלית מבוססת על תופעה שתאי הגידול מתרבים במהירות, ובמקביל רבים מהם עוברים אפופטוזיס ונמק. זה מוביל לשחרור פסולת תא אפופטוטי לדם של המטופלים, יחד עם שברי ה- DNA שנחתכים בגדלים מדויקים במהלך אפופטוזיס¹⁷. האפופטוזיס של תאים לא סרטניים מוביל גם לשחרור הפסולת התאית שלו לדם, עם זאת, שיעור האפופטוזיס בתאים אלה נמוך יחסית לתאי הגידול¹⁸. הרציונל של טכניקת הביופסיה הנוזלית הוא ללכוד מולקולות הקשורות לגידולים כגון DNA, RNA, חלבונים ותאי גידול^14,19 אשר מסתובבים ברציפות בדם. טכניקות שונות²⁰ ניתן להשתמש לניתוח של מולקולות אלה כולל הדור הבא רצף (NGS), תגובת שרשרת פולימראז טיפה דיגיטלית (ddPCR), PCR בזמן אמת, ואנזים מקושר immunosorbent assay (ELISA). טכניקת ביופסיה נוזלית מאפשרת זיהוי סמנים ביולוגיים שהם מאפיינים של תאים סרטניים. מולקולות סמן ביולוגי אלה אינן משתחררות רק מחלקים מסוימים של גידול, אלא מכל חלקי הגידול²¹. לפיכך, סמנים שזוהו בביופסיה נוזלית מייצגים את הפרופיל המולקולרי של גידול הטרוגנטי שלם, בנוסף לגידולים אחרים בגוף, ובכך, יש יתרונות על טכניקה מבוססת ביופסיה רקמה²².

cfDNA יש זמן מחצית חיים קצר בדם במחזור הנע בין כמה דקות 1-2 שעות²³. עם זאת, זמן מחצית החיים הקצר של cfDNA מקל על ניתוחים בזמן אמת על ידי הערכת תגובת הטיפול והערכות גידול דינמי. רמות cfDNA שמקורן בגידול מצביעות על פרוגנוסטיזציה של שלב הגידול / גודל העיד על ידי מספר מחקרים, אשר הראו קשר בין רמות cfDNA ותוצאות ההישרדות²⁴. יתר על כן, מחקרים הוכיחו כי cfDNA יש יכולת חיזוי טובה יותר מאשר סמני הגידול הקיימים²⁵. הפרוגנוסטיזציה של cfDNA בולטת עוד יותר לאחר טיפול בסרטן, רמות גבוהות יותר של cfDNA בעקבות הטיפול בקורלציה טובה עם שיעור הישרדות מופחת, ועמידות לטיפול. בעוד, רמות נמוכות יותר של cfDNA בעקבות טיפול בדרך כלל מתאים עם תגובה טיפולית חיובית. בנוסף, cfDNA מאפשר גילוי מוקדם של תגובת טיפול מאשר שיטות הגילוי המסורתיות.

CFDNA מגביר את האפשרות של גילוי מוקדם של מוטציות הקשורות לסרטן: במהלך מחלה בשלב מוקדם¹⁵, תחילת הסימפטומים²⁶ ולפני אבחון סרטן עד 2 שנים²⁷. כמו cfDNA משתחרר מאזורי גידול מרובים או מוקדים, הניתוח שלה מספק תצוגה מקיפה של הגנום הגידול הוא מייצג²⁸. לכן, cfDNA מאפשר לזהות מוטציות סומטיות שאולי הוחמצו בדגימות הרקמה²⁹. כמו הטרוגניות תוך גידול מוטציות תת שבטיות ניתן לזהות על ידי רצף עמוק של אזורים גנומיים פורש אלפי בסיסים, ומכאן הניתוח של cfDNA מאפשר לחשוף תת סוגים מולקולריים ספציפיים עם חתימות גנומיות ברורות¹³. כדי להשיג רמה דומה של מידע באמצעות דגימת רקמה ביופסיות מוצקות רבות היה צורך.

יתר על כן, רמות cfDNA בחולים עם מחלה מקומית כגון המעי הגס, השחלות, וסרטן הריאות לאחר טיפול כירורגי ו / או כימותרפיה, הוכיח להיות סמן פרוגנוסטי רב עוצמה עבור הישנות סרטן ותוצאות הטיפול²⁰. יתר על כן, בחולים עם סרטן המעי הגס, השד והריאות, ניתוחים של cfDNA מהדם יכול לזהות בהצלחה את השינויים ספציפיים לגידול, מה שהוביל לחיזוי מדויק של הישנות מספר חודשים מראש¹³. יתר על כן, סמני עמידות לטיפול, כגון מוטציות KRAS בחולים עם CRC קבלת טיפול נגד EGFR³⁰; VAFs עבור גנים כגון PIK3CA, MED1 או EGFR בחולים עם סרטן השד לאחר הטיפול עם טיפולים שונים³¹; מוטציית התנגדות EGFR T790M בחולי סרטן ריאות שטופלו TKIs ממוקד EGFR³² ניתן לזהות גם על ידי ניתוח cfDNA.

לסיכום, ניתוח cfDNA יכול לשמש לזיהוי סמנים ביולוגיים מדויקים בתחום האונקולוגיה^13,33. בפרוטוקול זה, דגימות דם של 3 חולי גליומה ו 3 פקדים בריאים עובדו כדי לקבל DNA גנומי מ WBCs ו cfDNA מהפלזמה. בסרטן גליומה, מוטציות IDH, TERT, ATRX, EGFR, ו TP53 משמש אבחון, כמו גם סמנים פרוגנוסטיים שעשויים לעזור באבחון מוקדם של גידולים גליומה, סיווג סוגים שונים של גידולים גליומה, המנחה את הטיפול המדויק עבור המטופל הפרט והבנת התגובה^{הטיפולית 34,35}. מצב מוטציה של גנים אלה ניתן לזהות באמצעות cfDNA שמקורו בדם. בכתב יד זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט של cfDNA שמקורו בפלזמה ששימש לחקר שינויים מוטציה בסרטן גליומה¹². כזה cfDNA מבוססי פרוטוקול ביופסיה נוזלית הסביר במאמר זה יכול לשמש לחקר שינויים מוטציה בסוגים רבים אחרים של סרטן. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי ביופסיה נוזלית מבוססת cfDNA יכולה לזהות 50 סוגים שונים של סרטן³⁶.

איסוף דגימת דם, אחסון, ומשלוח הם צעדים מכריעים בפרוטוקול זה, כמו טמפרטורה בלתי מבוקרת במהלך שלבים אלה גורם תמוגה של WBCs, המוביל לשחרור של DNA גנומי מן WBC לתוך הפלזמה ולגרום לזיהום של מדגם cfDNA, אשר משפיע על שאר ההליך³⁷. המוליזה עקב טמפרטורה בלתי מבוקרת עלולה לפגוע בתהליכי הכנת מדגם במורד הזרם של cfDNA, כגון שלבים PCR³⁸. הסרום מכיל שיעור גבוה של נבט cfDNA ולא פלזמה, למרות שהוא מציג רעש רקע גדול עבור cfDNA הקשורים לגידול³⁹. לכן, עבור בידוד cfDNA הקשורים לגידול, פלזמה היא מדגם מתאים³⁹. דם נמשך צינור איסוף דם המכיל קרישה צריך להיות צנטריפוגה מיד או בתוך שעתיים, כדי להפריד את הפלזמה כדי למנוע זיהום cfDNA. בפרוטוקול זה, צינורות ייעודיים לשימור cfDNA דם שימור משמשים (ראה טבלה של חומרים), המהווים חלופה נוגדי קרישה המכילים צינורות איסוף דם. אלה צינורות איסוף דם ייעודי לשמר cfDNA ו cfRNA, ומונע תמוגה של WBCs עד 30 ימים בטמפרטורת הסביבה, ועד 8 ימים ב 37 °C (69 °F). זה מקל על שמירה על הטמפרטורה המתאימה במהלך משלוח דגימת דם ועד הפלזמה ו- WBC מופרדים⁴⁰.

ישנם שלושה סוגים של מתודולוגיות מיצוי cfDNA זמין כיום: בידוד פאזה, טור ספין מבוסס סיליקון קרום, ובידוד מבוסס חרוז מגנטי⁴¹. שיטת עמודת ספין מבוססת ממברנת סיליקון הניבה כמות גבוהה של cfDNA עם שלמות גבוהה בהשוואה לשיטות חילוץ cfDNA אחרות⁴².

ההערכה הכמותית של ה- DNA היא דרישה בסיסית בביופסיה נוזלית, יש צורך לפתח הליך פשוט, סביר ומתוקנן ליישומם הקל ולשימוש רחב. שלוש שיטות נפוצות לכימות cfDNA הן ספקטרופוטומטריות, פלואורימטריות ו- qPCR. השיטה הפלואורימטרית מוכחת טוב יותר על פני שיטות אחרות לגבי הדיוק, העלות וקלות ההולכה⁴³.

השלמות והטוהר של cfDNA ניתן להעריך על ידי אלקטרופורזה agarose או אלקטרופורזה נימי. אלקטרופורזה אגרוז לא מראה רגישות בריכוז נמוך של cfDNA וגם אין רזולוציה גבוהה כדי להראות גודל שבר מדויק של cfDNA. מצד שני, אלקטרופורזה נימי יש יתרון על אלקטרופורזה agarose על ידי התגברות על האתגרים הקשורים, ולכן, בשימוש נרחב על ידי החוקרים לניתוח גודל שבר cfDNA. בפרוטוקול זה, התפלגות גודל הקטע של cfDNA מבודד הוערך באמצעות מכשיר אלקטרופורזה נימי אוטומטי (ראה טבלה של חומרים).

Protocol

לפני איסוף הדם, נדרשת הסכמה מדעת של הנבדקים המשתתפים במחקר ויש להשיגה. המחקר המתואר בכתב יד זה בוצע בהתאם לעמידה במרכז הרפואי רבין, בוועדת האתיקה הישראלית (קוד אתי: 0039-17-RMC) ובפקולטה לרפואה דר כריסטיאן-אלברכטס-אוניברסיטת זו קיל, ועדת האתיקה של גרמניה (קוד אתי: ד’ 405/14). 1. איסוף ואח…

Representative Results

הפרדת פלזמה8.5-9 דם מ”ל שנאסף cfDNA או cfRNA צינורות משמרים מניב סביב ~ 4 פלזמה מ”ל בנפח. נפח הפלזמה המופרדת מדם שנאסף בצינורות EDTA עשוי להשתנות בהתאם לטמפרטורה. חשיפה של צינורות EDTA המכילים דם בטמפרטורה גבוהה מ 37 מעלות צלזיוס מוביל לירידה בתפוקת נפחהפלזמה 44. <str…

Discussion

איסוף הדם של המטופל בצינור, משלוח ואחסון הם צעדים ראשוניים חיוניים בביופסיה נוזלית. טיפול לא נכון יכול לפגוע באיכות הפלזמה, ולכן, יכול להפריע לתוצאות הביופסיה הנוזלית⁴⁷. אם דגימת דם נאספת בצינור דם EDTA, הפלזמה חייבת להיות מופרדת בתוך שעתיים של איסוף הדם, כדי למנוע תמוגה של WBCs ושח…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C