Detección de ADN libre de células en muestras de plasma sanguíneo de pacientes con cáncer

Summary

En este artículo presentamos un protocolo detallado para la técnica de biopsia líquida no invasiva, incluyendo recolección de sangre, separación de plasma y capa buffy, extracción de ADN cfDNA y germinlina, cuantificación del ADN cfDNA o de la línea germinal, y análisis de enriquecimiento de fragmentos cfDNA.

Abstract

Identificar mutaciones en tumores de pacientes con cáncer es un paso muy importante en el manejo de enfermedades. Estas mutaciones sirven como biomarcadores para el diagnóstico tumoral, así como para la selección del tratamiento y su respuesta en pacientes con cáncer. El método estándar de oro actual para detectar mutaciones tumorales implica una prueba genética del ADN tumoral mediante biopsias tumorales. Sin embargo, este método invasivo es difícil de realizar repetidamente como una prueba de seguimiento del repertorio mutacional tumoral. La biopsia líquida es una técnica nueva y emergente para detectar mutaciones tumorales como un enfoque de biopsia fácil de usar y no invasivo.

Las células cancerosas se multiplican rápidamente. Paralelamente, numerosas células cancerosas se someten a apoptosis. Los desechos de estas células se liberan en el sistema circulatorio de un paciente, junto con piezas de ADN finamente fragmentadas, llamadas fragmentos de ADN libre de células (CFDNA), que llevan mutaciones del ADN tumoral. Por lo tanto, para identificar biomarcadores basados en CFDNA utilizando la técnica de biopsia líquida, se recogen muestras de sangre de los pacientes con cáncer, seguidas de la separación del plasma y la capa buffy. A continuación, el plasma se procesa para el aislamiento de cfDNA, y la capa de buffy respectiva se procesa para el aislamiento del ADN genómico de un paciente. A continuación, se comprueban ambas muestras de ácido nucleico en busca de su cantidad y calidad; y se analizaron para detectar mutaciones utilizando técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS).

En este manuscrito, presentamos un protocolo detallado para la biopsia líquida, incluyendo la recolección de sangre, plasma y separación de capa buffy, extracción de ADN cfDNA y germlina, cuantificación del ADN cfDNA o germinina, y análisis de enriquecimiento de fragmentos cfDNA.

Introduction

Los avances tecnológicos han llevado a la secuenciación de cientos de genomas y transcriptomas de cáncer^1. Esto ha contribuido a comprender los paisajes de cambios moleculares en diferentes tipos de cáncer^2. Otros estudios sobre estos paisajes han ayudado a caracterizar las alteraciones somáticas secuenciales y las fusiones génicas-génicas³ que están implicadas en el cáncer o la progresión tumoral, al interrumpir en serie las vías de apoptosis^4. Por lo tanto, las mutaciones somáticas y las fusiones génicas pueden proporcionar información sobre tumores sirviendo como biomarcadores en pacientes individuales para un tumor particular tipo^5,identificando el pronóstico de tumores primarios existentes^6,categorizando tumores secundarios basados en cambios moleculares^7,e identificando dianas tumorales farmacológicas^8. Dicha información puede facilitar la selección de tratamientos personalizados para pacientes con cáncer y en la determinación de respuestas positivas y negativas al tratamiento^9. Sin embargo, la obtención de material tumoral para identificar el perfil genómico del tejido tumoral es un procedimiento invasivo^10. Además, una biopsia tumoral comprende sólo una pequeña parte de un tumor heterogéneo; y, por lo tanto, no ser representativo para el perfil molecular de todo el tumor^11. El monitorización en serie y el genotipado tumoral requieren una recopilación repetida de tejidos tumorales, que, por lo general, no es factible debido a la invasión del procedimiento de biopsia tumoral y a los problemas de seguridad que surgen de dichos procedimientos^12.

La técnica de biopsia líquida, por otro lado, ha ganado una enorme atención en oncología de precisión en la última década^13,14. Se debe principalmente a la no invasión de esta técnica, y a la posibilidad de que se repita en múltiples puntos de tiempo, lo que permite una técnica de monitorización fácil de usar y segura para los cursos de la enfermedad^15,16. La biopsia líquida se basa en un fenómeno de que las células tumorales se multiplican rápidamente, y al mismo tiempo muchas de ellas se someten a apoptosis y necrosis. Esto conduce a la liberación de restos celulares apoptóticos en la sangre de los pacientes, junto con los fragmentos de ADN que se cortan en tamaños precisos durante la apoptosis^17. La apoptosis de las células no cancerosas también conduce a la liberación de sus desechos celulares en la sangre, sin embargo, la tasa de apoptosis en estas células es relativamente mucho menor que las células tumorales^18. La razón de la técnica de biopsia líquida es capturar moléculas asociadas al tumor como ADN, ARN, proteínas y células tumorales^14,19 que circulan continuamente en la sangre. Varias técnicas²⁰ se pueden utilizar para el análisis de estas moléculas, incluyendo secuenciación de próxima generación (NGS), reacción en cadena de la polimerasa de gota digital (ddPCR), PCR en tiempo real y ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA). La técnica de biopsia líquida permite identificar biomarcadores que son características de las células tumorales. Estas moléculas de biomarcador no sólo se liberan de partes específicas de un tumor, sino más bien de todas las partes del tumor^21. Por lo tanto, los marcadores identificados en la biopsia líquida representan el perfil molecular de todo un tumor heterogéneo, además de otros tumores en el cuerpo, por lo tanto, tener ventajas sobre la técnica basada en biopsia de tejido^22.

El cfDNA tiene un corto tiempo de vida media en la sangre circulante que va desde unos minutos hasta 1-2 horas^23. Sin embargo, el corto tiempo de vida media de cfDNA facilita los análisis en tiempo real mediante la evaluación de la respuesta al tratamiento y evaluaciones dinámicas del tumor. Los niveles de CFDNA derivados del tumor indican el pronóstico de la etapa/tamaño del tumor evidenciado por varios estudios, que mostraron una relación entre los niveles de CFDNA y los resultados de supervivencia^24. Además, los estudios han demostrado que el CFDNA tiene una mejor capacidad de predicción que los marcadores tumorales existentes^25. El pronóstico del CFDNA es aún más pronunciado después del tratamiento oncológico, los niveles más altos de CFDNA después del tratamiento se correlacionan bien con una tasa reducida de supervivencia y resistencia al tratamiento. Mientras que, los niveles más bajos de CFDNA después del tratamiento generalmente corresponden con la respuesta positiva al tratamiento. Además, el CFDNA facilita la detección precoz de la respuesta al tratamiento que los métodos de detección tradicionales.

El CFDNA aumenta la posibilidad de detección precoz de mutaciones asociadas al cáncer: durante la enfermedad en etapa temprana^15,la aparición de síntomas²⁶ y antes del diagnóstico de cáncer de hasta 2 años^27. Como cfDNA se libera de múltiples regiones tumorales o focos, su análisis proporciona una visión completa del genoma tumoral que representa^28. Por lo tanto, el CFDNA permite detectar mutaciones somáticas que podrían haberse perdido en las muestras de tejido^29. Como la heterogeneidad intra-tumoral y las mutaciones subclonales pueden ser detectadas por la secuenciación profunda de regiones genómicas que abarcan miles de bases, por lo tanto el análisis de la CFDNA permite descubrir subtipos moleculares específicos con firmas genómicas distintas^13. Para obtener un nivel similar de información a través de la muestra de tejido se habrían necesitado muchas biopsias sólidas.

Además, los niveles de CFDNA en pacientes con una enfermedad localizada como el cáncer de colon, ovario y pulmón después de un tratamiento quirúrgico y/o quimioterapia, demostraron ser un potente marcador pronóstico para la recurrencia del cáncer y los resultados del tratamiento^20. Además, en pacientes con cáncer de colon, mama y pulmón, los análisis de cfDNA de la sangre pudieron detectar con éxito los cambios específicos del tumor, lo que llevó a la predicción precisa de recurrencia con varios meses de antelación^13. Además, los marcadores de resistencia al tratamiento, como mutaciones KRAS en pacientes con CRC que reciben tratamiento anti-EGFR^30; VAF para genes como PIK3CA, MED1 o EGFR en pacientes con cáncer de mama después del tratamiento con diversas terapias^31; y la mutación de resistencia al EGFR T790M en pacientes con cáncer de pulmón tratados con TKIs³² dirigidos por EGFR también se puede identificar mediante el análisis cfDNA.

En resumen, el análisis cfDNA se puede utilizar para identificar biomarcadores precisos en el campo de la oncología^13,33. En este protocolo, se procesaron muestras de sangre de 3 pacientes con glioma y 3 controles sanos para obtener ADN genómico de los WBC y cfDNA del plasma. En el cáncer de glioma, las mutaciones en IDH, TERT, ATRX, EGFR y TP53 sirven como un diagnóstico, así como marcadores pronósticos que pueden ayudar en el diagnóstico precoz de tumores de glioma, clasificando diferentes tipos de tumores de glioma, guiando el tratamiento preciso para el paciente individual y entendiendo la respuesta al tratamiento^34,35. El estado mutacional de estos genes se puede identificar utilizando CFDNA derivado de la sangre. En este manuscrito, presentamos un protocolo detallado de cfDNA derivado del plasma que se ha utilizado para estudiar los cambios mutacionales en el cáncer de glioma^12. Este protocolo de biopsia líquida basado en cfDNA explicado en este artículo se puede utilizar para estudiar los cambios mutacionales en muchos otros tipos de cánceres. Además, un estudio reciente ha demostrado que la biopsia líquida basada en cfDNA puede detectar 50 tipos diferentes de cánceres^36.

La recolección, almacenamiento y envío de muestras de sangre son pasos cruciales en este protocolo, ya que la temperatura incontrolada durante estos pasos causa lisis de los WBC, lo que conduce a la liberación de ADN genómico del CMB en el plasma y causa contaminación de la muestra cfDNA, que afecta al resto del procedimiento^37. La hemólisis debido a la temperatura incontrolada puede afectar los procesos de preparación de muestras aguas abajo de cfDNA, como los pasos^{PCR 38}. El suero contiene una alta proporción de cfDNA germinal en lugar de plasma, aunque presenta un gran ruido de fondo para cfDNA³⁹asociado al tumor. Por lo tanto, para aislar el cfDNA asociado al tumor, el plasma es una muestra adecuada^39. La sangre extraída en un anti-coagulante que contenga tubo de recolección de sangre debe reducirse inmediatamente o en un plazo de hasta dos horas, para separar el plasma y evitar la contaminación por CFDNA. En este protocolo, se utilizan tubos de recolección de sangre dedicados a la conservación comercial cfDNA (ver Tabla de Materiales),que son una alternativa al anticoagulante que contiene tubos de recolección de sangre. Estos tubos dedicados de recolección de sangre preservan cfDNA y cfRNA, y previenen la lisis de los WBC durante un tiempo de hasta 30 días a temperatura ambiente, y hasta 8 días a 37 °C. Esto facilita el mantenimiento de la temperatura adecuada durante un envío de muestras de sangre y hasta que el plasma y el CMB se separan^40.

Actualmente hay tres tipos de metodologías de extracción cfDNA disponibles: aislamiento de fase, columna de espín a base de membrana de silicio y aislamiento magnético basado en cuentas^41. El método de columna de espín basado en membrana de silicio produjo una gran cantidad de cfDNA con alta integridad en comparación con otros métodos de extracción cfDNA⁴².

La evaluación cuantitativa del ADN es un requisito fundamental en la biopsia líquida, hay una necesidad de desarrollar un procedimiento simple, asequible y estandarizado para su fácil implementación y uso amplio. Tres métodos comúnmente utilizados para la cuantificación cfDNA son espectrofotométricos, fluorimétricos y qPCR. El método fluorimétrico se demuestra mejor que los demás métodos relativos a la precisión, el costo y la facilidad de conducción^43.

La integridad y pureza del cfDNA se puede estimar mediante electroforesis agarose o electroforesis capilar. La electroforesis de agarose no muestra sensibilidad a baja concentración de CFDNA ni tiene alta resolución para mostrar un tamaño preciso de fragmentos de CFDNA. Por otro lado, la electroforesis capilar tiene una ventaja sobre la electroforesis de agarose al superar los desafíos asociados y, por lo tanto, ampliamente utilizado por los investigadores para el análisis del tamaño de fragmentos cfDNA. En este protocolo, la distribución del tamaño del fragmento de cfDNA aislado se estimó utilizando un instrumento automatizado de electroforesis capilar (véase Tabla de materiales).

Protocol

Antes de la recolección de sangre, se requiere el consentimiento informado de los sujetos que participan en la investigación y deben obtenerse. La investigación descrita en este manuscrito se realizó de acuerdo con el Centro Médico Rabin, el comité ético de Israel (código ético: 0039-17-RMC) y la Facultad de Medicina Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Comité ético de Alemania (código ético: D 405/14). 1. Recolección y almacenamiento de muestras de sangre en tubos conserv…

Representative Results

Separación por plasma8.5-9 mL de sangre recolectada en tubos conservantes cfDNA o cfRNA produce alrededor de ~4 ml de plasma en volumen. El volumen de plasma separado de la sangre recolectada en tubos EDTA puede variar dependiendo de la temperatura. La exposición de tubos EDTA que contienen sangre a una temperatura superior a 37 °C conduce a una disminución del rendimiento del volumen plasmático44. Resultados del ensayo del fluorómetro…

Discussion

La recolección de sangre de un paciente en un tubo, envío y almacenamiento son pasos iniciales cruciales en la biopsia líquida. El manejo inadecuado puede afectar la calidad del plasma y, por lo tanto, puede interferir con los resultados de la biopsia líquida^47. Si se recoge una muestra de sangre en un tubo sanguíneo EDTA, el plasma debe separarse dentro de las dos horas posteriores a la recolección de sangre para evitar la lisis de los WBC y liberar su ADN genómico en el plasma<sup class="…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C