Rilevamento di DNA privo di cellule in campioni di plasma sanguigno di pazienti oncologici

Summary

In questo articolo presentiamo un protocollo dettagliato per la tecnica della biopsia liquida non invasiva, tra cui la raccolta del sangue, la separazione del mantello plasmatico e buffy, l’estrazione del DNA cfDNA e germinale, la quantificazione del DNA cfDNA o germinale e l’analisi dell’arricchimento dei frammenti cfDNA.

Abstract

Identificare le mutazioni nei tumori dei pazienti oncologici è un passo molto importante nella gestione delle malattie. Queste mutazioni fungono da biomarcatori per la diagnosi del tumore, nonché per la selezione del trattamento e la sua risposta nei pazienti oncologici. L’attuale metodo gold standard per rilevare le mutazioni tumorali comporta un test genetico del DNA tumorale attraverso biopsie tumorali. Tuttavia, questo metodo invasivo è difficile da eseguire ripetutamente come test di follow-up del repertorio mutazionale tumorale. La biopsia liquida è una tecnica nuova ed emergente per rilevare le mutazioni tumorali come approccio di biopsia facile da usare e non invasivo.

Le cellule tumorali si moltiplicano rapidamente. In parallelo, numerose cellule tumorali subiscono l’apoptosi. I detriti di queste cellule vengono rilasciati nel sistema circolatorio di un paziente, insieme a pezzi di DNA finemente frammentati, chiamati frammenti di DNA senza cellule (cfDNA), che portano mutazioni del DNA tumorale. Pertanto, per identificare i biomarcatori a base di CFDNA utilizzando la tecnica della biopsia liquida, i campioni di sangue vengono raccolti dai pazienti oncologici, seguiti dalla separazione del plasma e del mantello di buffy. Successivamente, il plasma viene elaborato per l’isolamento del cfDNA e il rispettivo strato di buffy viene elaborato per l’isolamento del DNA genomico di un paziente. Entrambi i campioni di acido nucleico vengono quindi controllati per verificarne la quantità e la qualità; e analizzato per le mutazioni utilizzando tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS).

In questo manoscritto, presentiamo un protocollo dettagliato per la biopsia liquida, tra cui la raccolta del sangue, la separazione del plasma e del mantello di buffy, l’estrazione del DNA cfDNA e germinale, la quantificazione del DNA cfDNA o germinale e l’analisi dell’arricchimento dei frammenti cfDNA.

Introduction

I progressi tecnologici hanno portato al sequenziamento di centinaia di genomi e trascrizioni tumorali¹. Ciò ha contribuito a comprendere paesaggi di cambiamenti molecolari in diversi tipi di^{cancro 2}. Ulteriori studi su questi paesaggi hanno contribuito a caratterizzare le alterazioni somatiche sequenziali e le fusioni gene-geniche^{3 che sono} coinvolte nella progressione del cancro o del tumore, interrompendo serialmente le vie di apoptosi⁴. Pertanto, mutazioni somatiche e fusioni gene-geniche possono fornire informazioni sui tumori servendo come biomarcatori nei singoli pazienti per un particolare tumore di^{tipo 5,}identificando la prognosi dei tumori primari^{esistenti 6,}categorizzando i tumori secondari in base ai^{cambiamenti molecolari 7}e identificando i target tumorali farmacogable⁸. Tali informazioni possono facilitare la selezione di trattamenti personalizzati per i pazienti oncologici e la determinazione delle risposte positive e negative al trattamento⁹. Tuttavia, ottenere materiale tumorale per identificare la profilazione genomica del tessuto tumorale è una procedura^{invasiva 10}. Inoltre, una biopsia tumorale comprende solo una piccola parte di un tumore eterogeneo; e può, quindi, non essere rappresentativo per il profilo molecolare dell’intero tumore¹¹. Il monitoraggio seriale e la genotipizzazione tumorale richiedono una raccolta ripetuta di tessuti tumorali, che, di solito, non è fattibile a causa dell’invasività della procedura di biopsia tumorale e dei problemi di sicurezza che derivano da tali^{procedure 12}.

La tecnica della biopsia liquida, d’altra parte, ha guadagnato un’enorme attenzione nell’oncologia di^{precisione nell’ultimo decennio 13,14}. Ciò è dovuto principalmente alla non invasività di questa tecnica e alla possibilità che venga ripetuta in più punti di tempo, consentendo così una tecnica di monitoraggio facile da usare e sicura per i corsi^{di malattia 15,16}. La biopsia liquida si basa su un fenomeno che le cellule tumorali si moltiplicano rapidamente, e contemporaneamente molte di esse subiscono apoptosi e necrosi. Ciò porta al rilascio di detriti cellulari apoptotici nel sangue dei pazienti, insieme ai frammenti di DNA che vengono tagliati a dimensioni precise durante l’apoptosi¹⁷. L’apoptosi delle cellule non cancerose porta anche al rilascio dei suoi detriti cellulari nel sangue, tuttavia, il tasso di apoptosi in queste cellule è relativamente molto inferiore alle cellule tumorali¹⁸. Il razionale della tecnica della biopsia liquida è quello di catturare molecole associate al tumore come DNA, RNA, proteine e cellule tumorali^14,19 che circolano continuamente nel sangue. Varie tecniche^{20 possono} essere utilizzate per l’analisi di queste molecole tra cui il sequenziamento di nuova generazione (NGS), la reazione a catena della polimerasi a goccia digitale (ddPCR), la PCR in tempo reale e il saggio immunoassorbente legato all’enzima (ELISA). La tecnica della biopsia liquida consente di identificare i biomarcatori che sono caratteristiche delle cellule tumorali. Queste molecole di biomarcatore non vengono rilasciate solo da parti specifiche di un tumore, ma piuttosto da tutte le parti del tumore²¹. Pertanto, i marcatori identificati nella biopsia liquida rappresentano il profilo molecolare di un intero tumore eterogeneo, oltre ad altri tumori nel corpo, avendo così vantaggi rispetto alla tecnica a base di biopsia tissutale²².

Il cfDNA ha un breve periodo di emidità nel sangue circolante che va da pochi minuti a 1-2 ore²³. Tuttavia, il breve periodo di emidità del cfDNA facilita le analisi in tempo reale valutando la risposta al trattamento e le valutazioni dinamiche del tumore. I livelli di CFDNA derivati dal tumore indicano la prognosticazione dello stadio/dimensione tumorale evidenziata da diversi studi, che hanno mostrato una relazione tra i livelli di CFDNA e gli esiti di^{sopravvivenza 24}. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che il cfDNA ha una capacità di previsione migliore rispetto ai marcatori tumorali^{esistenti 25}. La prognosticazione del cfDNA è ancora più pronunciata dopo il trattamento del cancro, livelli più elevati di cfDNA dopo il trattamento sono ben correlati con un tasso ridotto di sopravvivenza e resistenza al trattamento. Mentre, livelli più bassi di cfDNA dopo la terapia corrispondono generalmente a una risposta positiva al trattamento. Inoltre, il cfDNA facilita la diagnosi precoce della risposta al trattamento rispetto ai metodi di rilevamento tradizionali.

Il cfDNA aumenta la possibilità di individuazione precoce delle mutazioni associate al cancro: durante la malattia in fase iniziale¹⁵, l’insorgenza^{dei sintomi 26 e} prima della diagnosi di cancro fino a 2^{anni 27}. Poiché cfDNA viene rilasciato da più regioni tumorali o focolai, la sua analisi fornisce una visione completa del genoma tumorale che rappresenta²⁸. Pertanto, il cfDNA consente di rilevare mutazioni somatiche che potrebbero essere mancate nei campioni di tessuto²⁹. Poiché l’eterogeneità intra-tumorale e le mutazioni subclonali possono essere rilevate sequenziando in profondità regioni genomiche che coprono migliaia di basi, quindi l’analisi del cfDNA consente di scoprire specifici sottotipi molecolari con distinte firme genomiche¹³. Per ottenere un livello simile di informazioni attraverso il campione di tessuto sarebbero state necessarie molte biopsie solide.

Inoltre, i livelli di cfDNA nei pazienti con una malattia localizzata come il cancro al colon, all’ovaio e al polmone dopo un trattamento chirurgico e / o chemioterapia, hanno dimostrato di essere un potente marcatore prognostico per la recidiva del cancro e gli esiti del^{trattamento 20}. Inoltre, nei pazienti con cancro al colon, al seno e al polmone, le analisi del cfDNA dal sangue potrebbero rilevare con successo i cambiamenti specifici del tumore, che hanno portato alla previsione precisa della recidiva con diversi mesi di^{anticipo 13}. Inoltre, i marcatori di resistenza al trattamento, come le mutazioni KRAS in pazienti con CRC che ricevono terapia anti-EGFR^30; VAF per geni come PIK3CA, MED1 o EGFR in pazienti con tumore al seno dopo il trattamento con varie terapie^31; e la mutazione della resistenza EGFR T790M nei pazienti con cancro ai polmoni trattati con TKI^{32 mirati} all’EGFR può anche essere identificata dall’analisi cfDNA.

In sintesi, l’analisi cfDNA può essere utilizzata per identificare biomarcatori precisi nel campo dell’oncologia^13,33. In questo protocollo, campioni di sangue di 3 pazienti con glioma e 3 controlli sani sono stati elaborati per ottenere DNA genomico da WBC e cfDNA dal plasma. Nel cancro al glioma, le mutazioni in IDH , TERT, ATRX, EGFR e TP53 servono come marcatori diagnostici e prognostici che possono aiutare nella diagnosi precoce dei tumori del glioma, classificando diversi tipi di tumori del glioma, guidando il trattamento accurato per il singolo paziente e comprendendo la risposta al^{trattamento 34,35}. Lo stato mutazionale di questi geni può essere identificato utilizzando cfDNA derivato dal sangue. In questo manoscritto, presentiamo un protocollo dettagliato di cfDNA derivato dal plasma che è stato utilizzato per studiare i cambiamenti mutazionali nel cancro al glioma¹². Tale protocollo di biopsia liquida a base di CFDNA spiegato in questo articolo può essere utilizzato per studiare i cambiamenti mutazionali in molti altri tipi di tumori. Inoltre, un recente studio ha dimostrato che la biopsia liquida a base di CFDNA può rilevare 50 diversi tipi di cancro³⁶.

La raccolta, lo stoccaggio e la spedizione dei campioni di sangue sono passaggi cruciali in questo protocollo, poiché la temperatura incontrollata durante questi passaggi causa lisi dei WBC, portando al rilascio di DNA genomico dal WBC nel plasma e causando la contaminazione del campione cfDNA, che influisce sul resto della procedura³⁷. L’emolisi dovuta alla temperatura incontrollata può compromettere i processi di preparazione del campione a valle di cfDNA, come i passaggi^{PCR 38}. Il siero contiene un’alta percentuale di cfDNA germinale piuttosto che plasma, sebbene presenti un grande rumore di fondo per cfDNA³⁹associato al tumore . Pertanto, per isolare il cfDNA associato al tumore, il plasma è un campione^{adatto 39}. Il sangue prelevato in un antico coagulante contenente un tubo di raccolta del sangue deve essere centrifugato immediatamente o entro un massimo di due ore, per separare il plasma ed evitare la contaminazione da CFDNA. In questo protocollo vengono utilizzati tubi di raccolta del sangue di conservazione cfDNA commerciali dedicati (vedi Tabella dei materiali), che sono un’alternativa all’anticoagulante contenente tubi di raccolta del sangue. Questi tubi dedicati per la raccolta del sangue preservano cfDNA e cfRNA e prevengono la llisi dei WBC per un massimo di 30 giorni a temperatura ambiente e fino a 8 giorni a 37 °C. Ciò facilita il mantenimento della temperatura appropriata durante una spedizione del campione di sangue e fino a quando il plasma e il WBC non^{sono separati 40}.

Esistono attualmente tre tipi di metodologie di estrazione cfDNA: isolamento di fase, colonna di spin a base di membrana di silicio e isolamento magnetico basato su perline⁴¹. Il metodo della colonna di spin a base di membrana di silicio ha prodotto un’elevata quantità di cfDNA ad alta integrità rispetto ad altri metodi di estrazione cfDNA⁴².

La valutazione quantitativa del DNA è un requisito fondamentale nella biopsia liquida, è necessario sviluppare una procedura semplice, conveniente e standardizzata per la loro facile implementazione e ampio utilizzo. Tre metodi comunemente usati per la quantificazione cfDNA sono spettrofotometrici, fluorimetrici e qPCR. Il metodo fluorimetrico si è dimostrato migliore rispetto agli altri metodi riguardanti l’accuratezza, il costo e la facilità di^{condotta 43}.

L’integrità e la purezza del cfDNA possono essere stimate mediante elettroforesi di agarosio o elettroforesi capillare. L’elettroforesi dell’agarosio non mostra sensibilità a bassa concentrazione di cfDNA né ha un’alta risoluzione per mostrare una dimensione precisa del frammento di cfDNA. D’altra parte, l’elettroforesi capillare ha un vantaggio rispetto all’elettroforesi dell’agarosio superando le sfide associate e, quindi, ampiamente utilizzata dai ricercatori per l’analisi delle dimensioni dei frammenti cfDNA. In questo protocollo, la distribuzione delle dimensioni dei frammenti del cfDNA isolato è stata stimata utilizzando uno strumento automatizzato di elettroforesi capillare (vedi Tabella dei materiali).

Protocol

Prima della raccolta del sangue, è richiesto e deve essere ottenuto il consenso informato dei soggetti che partecipano alla ricerca. La ricerca descritta in questo manoscritto è stata eseguita in conformità con il Rabin Medical Center, israele etico committee (codice etico: 0039-17-RMC) e la Facoltà di Medicina Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Comitato etico tedesco (codice etico: D 405/14). 1. Raccolta e conservazione di campioni di sangue in tubi conservanti cfDNA o cfRNA …

Representative Results

Separazione al plasma8,5-9 ml di sangue raccolto in tubi conservanti cfDNA o cfRNA produce circa ~ 4 ml di plasma in volume. Il volume di plasma separato dal sangue raccolto nei tubi EDTA può variare a seconda della temperatura. L’esposizione di tubi EDTA contenenti sangue ad una temperatura superiore a 37 °C porta a una diminuzione della resa del volumeplasmatico 44. Risultati saggio fluorometroLa concentrazione di cfDNA nel …

Discussion

La raccolta del sangue di un paziente in un tubo, la spedizione e lo stoccaggio sono i primi passi cruciali nella biopsia liquida. Una manipolazione impropria può compromettere la qualità del plasma e, pertanto, può interferire con i risultati della biopsia^{liquida 47}. Se un campione di sangue viene raccolto in un tubo sanguigno EDTA, il plasma deve essere separato entro due ore dalla raccolta del sangue per evitare la lisi dei WBC e il rilascio del suo DNA genomico nel plasma^4…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C