Schlaganfall ist ein globales Problem mit minimalen Behandlungsmöglichkeiten und keiner aktuellen klinischen Therapie zur Regeneration des verlorenen Hirngewebes. Hier beschreiben wir Methoden zur Erzeugung eines präzisen photothrombotischen Schlaganfalls im motorischen Kortex von Nagetieren und der anschließenden Injektion von Hydrogel-Biomaterialien, um ihre Auswirkungen auf die Geweberegeneration nach einem Schlaganfall zu untersuchen.
Schlaganfall ist die Hauptursache für Behinderung und die fünfthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Etwa 87% aller Schlaganfälle sind ischämische Schlaganfälle und werden als plötzliche Blockade eines Gefäßes definiert, das das Gehirn mit Blut versorgt. Innerhalb weniger Minuten nach der Blockade beginnen die Zellen zu sterben und führen zu irreparablen Gewebeschäden. Aktuelle therapeutische Behandlungen konzentrieren sich auf die Entfernung oder Lyse von Gerinnseln, um die Reperfusion zu ermöglichen und schwerere Hirnschäden zu verhindern. Obwohl die vorübergehende Plastizität des Gehirns im Laufe der Zeit einen Teil des beschädigten Gewebes retten kann, bleiben signifikante Teile der Patienten mit neurologischen Defiziten zurück, die sich nie auflösen werden. Es fehlt an therapeutischen Optionen zur Behandlung neurologischer Defizite, die durch Einen Schlaganfall verursacht werden, was die Notwendigkeit unterstreicht, neue Strategien zur Behandlung dieser wachsenden Patientenpopulation zu entwickeln. Injizierbare Biomaterialien werden derzeit entwickelt, um die Plastizität des Gehirns zu verbessern und die endogene Reparatur durch die Abgabe von Wirkstoffen oder Stammzellen zu verbessern. Eine Methode, um diese Ansätze zu testen, besteht darin, ein Nagetierschlagmodell zu verwenden, das Biomaterial in den Schlaganfallkern zu injizieren und die Reparatur zu bewerten. Die genaue Lage des Schlaganfallkerns zu kennen, ist für die genaue Behandlung nach dem Schlaganfall unerlässlich, daher ist ein Schlaganfallmodell, das zu einem vorhersagbaren Schlaganfallort führt, vorzuziehen, um die Notwendigkeit einer Bildgebung vor der Injektion zu vermeiden. Das folgende Protokoll behandelt, wie man einen photothrombotischen Schlaganfall induziert, wie man ein Hydrogel kontrolliert und präzise injiziert und wie man das Gehirn extrahiert und kryosektioniert, während das Biomaterial intakt bleibt. Darüber hinaus werden wir aufzeigen, wie dieselben Hydrogelmaterialien für die Co-Delivery von Stammzellen verwendet werden können. Dieses Protokoll kann auf die Verwendung anderer injizierbarer Biomaterialien in den Schlaganfallkern verallgemeinert werden.
Schlaganfall ist die Hauptursache für Behinderung und die fünfthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten1. Ungefähr 87% aller Schlaganfälle sind ischämisch, während eine Mehrheit der restlichen 13% hämorrhagischist 2. Ein ischämischer Schlaganfall ist definiert als die Blockade des Blutflusses in einer Arterie zum umgebenden Gewebe. Dieser Verschluss führt zu Sauerstoffmangel und anschließender Nekrose, die bei überlebenden Patienten oft zu dauerhaften Behinderungen führt. Während die Sterblichkeitsrate von Schlaganfall3zurückgegangen ist, wird erwartet, dass seine Prävalenz bis 2030 auf 3,4 Millionen Menschen ansteigen wird4. Diese Zunahme behinderter Überlebender und die daraus resultierende wirtschaftliche Belastung haben zu einem Vorstoß für die Schlaganfallforschung geführt, die sich auf Mechanismen der neuronalen Reparatur konzentriert. Nach dem Schlaganfall kommt es zu einer entzündlichen Periode, die zur Bildung einer Narbe führt, die verhindert, dass sich die nekrotische Region ausdehnt. Die Region, die den nekrotischen Kern umgibt, wird als “Periinfarkt” bezeichnet, und es gibt starke Hinweise darauf, dass die Plastizität in dieser Region, die eine erhöhte Angiogenese, Neurogenese und axonale Keimung umfasst, direkt mit der beobachteten Erholung bei Tiermodellen und Menschen zusammenhängt5. Da es keine In-vitro-Modelle gibt, die die komplexen Wechselwirkungen nach einem Schlaganfall richtig replizieren können, sind Tiermodelle für die Schlaganfallforschung unerlässlich.
Es gibt mehrere In-vivo-Modelle, die verwendet werden können, um einen ischämischen Schlaganfall zu erzeugen. Eines der häufigsten Modelle, die bei Mäusen verwendet werden, ist der Verschluss der mittleren Hirnarterie oder MCAo durch distalen oder proximalen (über intraarteriale Filamente) Verschluss. Das proximale Modell, auch bekannt als Filament MCAo (fMCAo), führt typischerweise zu großen ischämischen Schlaganfällen, die zwischen 5% und 50% der gehirnförmigen Hemisphäre umfassen, abhängig von der Anzahl der Faktoren6. In diesen Modellen wird eine Naht oder ein Filament von der Arteria carotis interna in die Basis der mittleren Hirnarterie (MCA) vorgeschoben und für einen bestimmten Zeitraum an Ort und Stelle gehalten. Diese Methode zur Okklusion, die vorübergehend oder dauerhaft gemacht werden kann, erzeugt einen Infarkt, der im Striatum zentriert ist und einen darüber liegenden Kortex beinhalten kann oder auch nicht6. Die resultierende Schlaggröße ist sehr variabel, und bildgebende Verfahren wie Laserdoppler sind erforderlich, um die Wirksamkeit des Verfahrens in jeder Maus zu bestätigen. Intraarterieller oder intralumnaler Filamentverschluss, der länger als 30 Minuten dauert, erzeugt Schläge am größeren Ende des Größenbereichs. Einige Forscher haben sich auf kürzere Filamentverschlusszeiten konzentriert, die einen erheblichen experimentellen Fokus und eine Laborvalidierung erfordern7. Filament-MCAo-Modelle bei Mäusen folgen ähnlichen Stadien des Zelltods, der ischämischen Progression und der Bildung einer Periinfarktregion, wie sie bei menschlichen Schlaganfallfällen beobachtet werden; Die größeren Schlaganfälle ähneln jedoch eher dem Krankheitszustand von bösartigen Hirninfarkten, die seltenere, weniger behandelbare menschliche Schlaganfälle sind6. In der Zwischenzeit erfordert der distale MCA-Verschluss eine aufwendigere Operation und Kraniektomie. In diesem Modell wird der distale Teil des MCA, der entlang der Oberfläche des Gehirns verläuft, direkt mit einer Nahtbindung oder Kauterisation verschlossen. In einigen Variationen der Technik sind die Halsschlagadern einseitig oder vorübergehend-bilateral verschlossen. Ein Vorteil des distalen MCAo besteht darin, dass er einen kortikalen Schlag erzeugt, dessen Größe weniger variabel ist als das Filamentmodell. Das distale Modell erzeugt jedoch aufgrund der Transektion der äußeren Halsschlagader (ECA) eine schlechtere Verhaltensleistung, was auch bei fMCAo 6 ein Problemdarstellt.
Ein alternatives Schlaganfallmodell, das dafür bekannt ist, weniger invasiv zu sein, ist das photothrombotische (PT) Modell. Das PT-Modell führt zu einem klar definierten Ort der Ischämie und ist mit einer hohen Überlebensrate assoziiert8. Die Technik beruht auf einem lichtempfindlichen Farbstoff, der intraperitoneal injiziert wird und die intravaskuläre Photooxidation einfach durch Bestrahlung des gewünschten Gewebes mit einem Licht oder Laserermöglicht 9. Bei Anregung bilden sich Sauerstoffradikale, die Endothelschäden verursachen, die die Thrombozytenaggregation und Gerinnselbildung im bestrahlten Bereich aktivieren8,9. Die strenge Kontrolle über Hubgröße und -position sowie die hohe Reproduzierbarkeit des PT-Modells machen es ideal für die Untersuchung von Biomaterialien. Während Präzision durch einen Laser und stereotaktische Koordinaten ermöglicht wird, gibt es einige Nachteile, die dieses Modell für wenige Studien weniger ideal machen können. Im Gegensatz zum fMCAo-Modell kann das PT-Hubmodell nicht reperfundiert werden. Daher wären Materialien zur Untersuchung neuroprotektiver Wirkstoffe, die spezifisch für Schäden nach Reperfusion oder die Mechanismen nach reperfusion sind, hier nicht sinnvoll8. Darüber hinaus wird aufgrund der mikrovaskulären Beleidigung des PT-Modells eine relativ kleine ischämische Penumbra gesehen. Stattdessen tritt ein lokales vasogenes Ödem auf, das für den menschlichen Schlaganfall untypisch ist, was dieses Modell für präklinische Arzneimittelstudien, die sich auf den Periinfarktbereichkonzentrieren,unerwünscht macht6,8.
Das übergeordnete Ziel von Biomaterialstrategien bei Schlaganfällen ist es, entweder bioaktive Wirkstoffe zu liefern oder als surrogatartige extrazelluläre Matrix für das Wachstum von Hirngewebe zu fungieren. Eine Strategie, die wir mit unseren Methoden untersuchen werden, besteht darin, Hydrogel direkt in den Schlaganfallkern zu liefern, im Gegensatz zum periinfarkten Gewebe, in dem viele aktuelle Zelltherapien verabreicht werden10. Die Begründung für diesen Ansatz ist, dass die Abgabe in das nekrotische Gewebe im Kern die Störung des umgebenden gesunden oder sich erholenden Gewebes vermeidet. Wir gehen davon aus, dass die Diffusion aller im Biomaterial enthaltenen Wirkstoffe in der Lage sein wird, den Periinfarkt vom Kern aus zu erreichen, zumal wir feststellen, dass die Abgabe von Hydrogel-Biomaterialien die Dicke der Glianarbe reduziert11. Dies ist wichtig, da gezeigt wurde, dass die Periinfarktregion nach einem Schlaganfall Neuroplastizität aufweist, was sie zu einem attraktiven Ziel macht. Darüber hinaus kann die Abgabe einer Surrogatmatrix an den Schlaganfallkern mit angiogenen12 oder neurogenen13 Faktoren beladen werden, um die Bildung von neuem Gewebe zu steuern, sowie Zellen für die Abgabe14. Die Zellabgabe wird durch die Verwendung einer Matrix erheblich verbessert, da sie die Zellen vor den harten Injektionskräften und der lokalen Umgebung schützt, die während der Entbindung vorhanden sind, sowie die Differenzierung und Transplantation fördert15.
Diese injizierbaren therapeutischen Biomaterialien haben klinische Relevanz bei Schlaganfallanwendungen, da es derzeit keine medizinischen Therapien gibt, die die neuronale Erholung nach einem Schlaganfall stimulieren. Die zugrunde liegenden neuronalen Schaltkreise, die an der Genesung beteiligt sind, liegen im Hirngewebe, das an den Schlaganfallkern16angrenzt, während der Schlaganfallkern selbst frei von lebensfähigem Nervengewebe ist. Wir gehen davon aus, dass die Abgabe eines Biomaterials in den nekrotischen Schlaganfallkern das Potenzial hat, das angrenzende Gewebe durch eine Reihe von zuvor erwähnten Mechanismen zu regenerativen Prozessen zu stimulieren, darunter die Depotfreisetzung von Wachstumsfaktoren13,die Stimulation des Gewebewachstums und die Förderung der Wiederherstellung der Entwicklung von Hirngewebe11,12, Veränderung der Immunantwort17und die Abgabe von aus Stammzellen abgeleitetenTherapeutika 14. 18. Um jedoch die Möglichkeit dieser Anwendungen effektiv zu untersuchen, ist eine konsistente und reproduzierbare Methode zur Induktion von Schlaganfällen und zur Injektion von Biomaterialien erforderlich. Das PT-Hubmodell verwendet Techniken, die eine präzise Kontrolle über die Ausrichtung und Position des Hubs bieten. Ein am stereotaktischen Gerät befestigter Laser führt die Ausrichtung, und an den stereotaktischen Geräten angebrachte Pumpen steuern die Injektionsrate des Materials, ohne dass zusätzliche Formen der Bildgebung erforderlich sind. Daher haben wir uns entschieden, die Methoden zur Durchführung eines PT-Schlaganfalls in den motorischen Kortexen von Mäusen und zur Injektion von Biomaterialien in den Schlaganfallkern zu beschreiben. Hier verwenden wir mikroporöse geglühte Partikel (MAP) Hydrogele als Biomaterial für die Injektion ohne Zusatz von Zellen oder Wachstumsfaktoren. Darüber hinaus erklären wir, wie man das Gehirn mit intaktem Biomaterial erfolgreich abrufen kann, und wir diskutieren immunchemische Assays, die zur Analyse des Schlaganfallergebnisses mit und ohne Injektion von Biomaterialien verwendet werden.
Hier zeigen wir ein leicht reproduzierbares, minimalinvasives, permanentes Schlaganfallmodell und beschreiben, wie fünf Tage nach dem Schlaganfall ein Biomaterial in den Infarkt injiziert werden kann. Die Verwendung des photothrombotischen Farbstoffs Rose Bengal und eines 520 nm kollimierten Lasers, der mit dem stereotaktischen Gerät verbunden ist, gibt uns die Möglichkeit, den Schlag mit erhöhter Präzision am motorischen Kortex der Maus zu positionieren. Fünf Tage nach dem Schlaganfall ist die Lage des Infarkts du…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den National Institutes of Health und dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke für die Finanzierung (R01NS079691).
10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax |
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
Student Adson Forceps -1×2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |