L’ictus è un problema globale con opzioni di trattamento minime e nessuna terapia clinica attuale per rigenerare il tessuto cerebrale perso. Qui descriviamo i metodi per creare un preciso colpo fototrombotico nella corteccia motoria dei roditori e la successiva iniezione di biomateriali idrogel per studiare i loro effetti sulla rigenerazione dei tessuti dopo l’ictus.
L’ictus è la principale causa di disabilità e la quinta causa di morte negli Stati Uniti. Circa l’87% di tutti gli ictus sono ictus ischemici e sono definiti come il blocco improvviso di un vaso che fornisce sangue al cervello. Entro pochi minuti dal blocco, le cellule iniziano a morire e provocano danni irreparabili ai tessuti. Gli attuali trattamenti terapeutici si concentrano sulla rimozione del coagulo o sulla lisi per consentire la riperfusione e prevenire danni cerebrali più gravi. Sebbene la plasticità cerebrale transitoria possa salvare parte del tessuto danneggiato nel tempo, frazioni significative di pazienti rimangono con deficit neurologici che non si risolveranno mai. C’è una mancanza di opzioni terapeutiche per trattare i deficit neurologici causati dall’ictus, sottolineando la necessità di sviluppare nuove strategie per trattare questa crescente popolazione di pazienti. I biomateriali iniettabili sono attualmente in fase di progettazione per migliorare la plasticità cerebrale e migliorare la riparazione endogena attraverso la somministrazione di agenti attivi o cellule staminali. Un metodo per testare questi approcci è quello di utilizzare un modello di colpo di roditore, iniettare il biomateriale nel nucleo dell’ictus e valutare la riparazione. Conoscere la posizione precisa del nucleo dell’ictus è fondamentale per il trattamento accurato dopo l’ictus, pertanto, un modello di ictus che si traduce in una posizione di ictus prevedibile è preferibile per evitare la necessità di imaging prima dell’iniezione. Il seguente protocollo tratterà come indurre un ictus fototrombotico, come iniettare un idrogel in modo controllato e preciso e come estrarre e criosezionare il cervello mantenendo intatto il biomateriale. Inoltre, evidenzieremo come questi stessi materiali idrogel possono essere utilizzati per la co-consegna di cellule staminali. Questo protocollo può essere generalizzato all’uso di altri biomateriali iniettabili nel nucleo dell’ictus.
L’ictus è la principale causa di disabilità e la quinta causa di morte negli Stati Uniti1. Circa l’87% di tutti gli ictus sono ischemici, mentre la maggior parte del restante 13% sono emorragici2. Un ictus ischemico è definito come il blocco del flusso sanguigno in un’arteria al tessuto circostante. Questa occlusione si traduce in privazione di ossigeno e successiva necrosi che spesso porta a disabilità permanente nei pazienti sopravvissuti. Mentre c’è stata una diminuzione del tasso di mortalitàdell’ictus 3, la sua prevalenza dovrebbe aumentare a 3,4 milioni di persone entro il 20304. Questo aumento dei sopravvissuti disabili e il conseguente onere economico ha portato a una spinta per la ricerca sull’ictus che si concentra sui meccanismi di riparazione neurale. Dopo l’ictus c’è un periodo infiammatorio che porta alla formazione di una cicatrice che impedisce alla regione necrotica di espandersi. La regione che circonda il nucleo necrotico è definita “peri-infarto” e vi è una forte evidenza che la plasticità in questa regione, che include l’aumento dell’angiogenesi, della neurogenesi e della germinazione assonale, è direttamente collegata al recupero osservato nei modelli animali e umani5. Poiché non esistono modelli in vitro in grado di replicare correttamente le complesse interazioni successive all’ictus, i modelli animali sono essenziali per la ricerca sull’ictus.
Esistono diversi modelli in vivo che possono essere utilizzati per produrre ictus ischemico. Uno dei modelli più comuni utilizzati nei topi è l’occlusione dell’arteria cerebrale media, o MCAo, attraverso l’occlusione distale o prossimale (tramite filamento intra-arterioso). Il modello prossimale, noto anche come filamento MCAo (fMCAo), in genere si traduce in grandi ictus ischemici che comprendono ovunque dal 5% al 50% dell’emisfero cerebrale, a seconda del numero di fattori6. In questi modelli, una sutura o un filamento viene avanzato dall’arteria carotide interna alla base dell’arteria cerebrale media (MCA) e mantenuto in posizione per un determinato periodo di tempo. Questo metodo per l’occlusione, che può essere reso temporaneo o permanente, produce un infarto centrato nello striato e può o meno coinvolgere la corteccia sovrastante6. La dimensione del tratto risultante è altamente variabile e sono necessarie tecniche di imaging, come il doppler laser, per confermare l’efficacia della procedura in ciascun topo. L’occlusione del filamento intra-arterioso o intra-luminale che dura più di 30 minuti produce ictus all’estremità più ampia dell’intervallo di dimensioni. Alcuni ricercatori si sono concentrati su tempi di occlusione del filamento più brevi, che richiedono una sostanziale attenzione sperimentale e la convalida del laboratorio7. I modelli di filamento MCAo nei topi seguono fasi simili di morte cellulare, progressione ischemica e formazione di una regione peri-infartuale come osservato nei casi di ictus umano; tuttavia, gli ictus più grandi assomigliano più da vicino allo stato di malattia degli infarti cerebrali maligni, che sono meno comuni, meno curabili ictus umani6. Nel frattempo, l’occlusione MCA distale richiede un intervento chirurgico e una craniectomia più coinvolti. In questo modello, la parte distale dell’MCA che corre lungo la superficie del cervello è direttamente occlusa con una cravatta di sutura o cauterizzazione. In alcune varianti della tecnica, le arterie carotidi sono unilateralmente occluse unilateralmente o transitoriamente-bilateralmente. Un vantaggio dell’MCAo distale è che produce una corsa a base corticale di dimensioni inferiori rispetto al modello di filamento. Tuttavia, il modello distale produce un output comportamentale più povero a causa della traselezione dell’arteria carotide esterna (ECA), che è anche una preoccupazione con fMCAo6.
Un modello di corsa alternativo che è noto per essere meno invasivo è il modello fototrombotico (PT). Il modello PT si traduce in una posizione ben definita di ischemia ed è associato ad un alto tasso di sopravvivenza8. La tecnica si basa su un colorante fotosensibile iniettato per via intraperitoneale che consente la foto-ossidazione intravascolare semplicemente irradiando il tessuto desiderato con una luce o un laser9. Dopo l’eccitazione, si formano radicali di ossigeno che causano danni endoteliali, che attivano l’aggregazione piastrinica e la formazione di coaguli nell’area irradiata8,9. Lo stretto controllo sulla dimensione e la posizione della corsa, nonché l’elevata riproducibilità del modello PT, lo rendono ideale per lo studio dei biomateriali. Mentre la precisione è resa possibile utilizzando un laser e coordinate stereotassiche, ci sono alcuni svantaggi che possono rendere questo modello meno ideale per pochi studi. A differenza del modello fMCAo, il modello di corsa PT non può essere riperfuso. Pertanto, i materiali per studiare gli agenti neuroprotettivi specifici per i danni a seguito di riperfusione o i meccanismi successivi alla riperfusione non sarebbero utili qui8. Inoltre, a causa dell’insulto microvascolare del modello PT, si vede una penombra ischemica relativamente piccola. Invece, si verifica edema vasogenico locale, che è insolito per l’ictus umano, rendendo questo modello indesiderabile per gli studi farmacologici preclinici focalizzati sull’area peri-infartuale6,8.
L’obiettivo generale delle strategie dei biomateriali nell’ictus è quello di fornire agenti bioattivi o di agire come una matrice extracellulare surrogata per la crescita del tessuto cerebrale. Una strategia che esploreremo utilizzando i nostri metodi è quella di fornire idrogel direttamente nel nucleo dell’ictus, al contrario del tessuto peri-infartuale in cui vengono somministrate molte terapie cellulari attuali10. Il razionale di questo approccio è che la consegna nel tessuto necrotico trovato nel nucleo eviterà di interrompere il tessuto sano circostante o di recuperare. Supponiamo che la diffusione di qualsiasi agente attivo incluso nel biomateriale sarà in grado di raggiungere il peri-infarto dal nucleo, soprattutto perché troviamo che la consegna di biomateriali idrogel riduce lo spessore della cicatrice gliale11. Questo è importante poiché la regione del peri-infarto ha dimostrato di mostrare neuroplasticità dopo l’ictus, rendendola un bersaglio attraente. Inoltre, la consegna di una matrice surrogata al nucleo dell’ictus può essere caricata con12 angiogenici o13 fattori neurogeni per guidare la formazione di nuovo tessuto, così come le cellule per la consegna14. La consegna cellulare è notevolmente migliorata utilizzando una matrice perché protegge le cellule dalle dure forze di iniezione e dall’ambiente locale presente durante il parto, oltre a incoraggiare la differenziazione e l’attecchimento15.
Questi biomateriali terapeutici iniettabili hanno rilevanza clinica nelle applicazioni dell’ictus, in quanto attualmente non esistono terapie mediche che stimolino il recupero neuronale dopo l’ictus. I circuiti neurali sottostanti coinvolti nel recupero si trovano nel tessuto cerebrale adiacente al nucleodell’ictus 16, mentre il nucleo dell’ictus stesso è privo di tessuto neurale vitale. Prevediamo che la consegna di un biomateriale nel nucleo dell’ictus necrotico ha il potenziale per stimolare il tessuto adiacente verso processi rigenerativi attraverso una serie di meccanismi precedentemente menzionati, tra cui il rilascio di depositi di fattori dicrescita 13,la stimolazione della crescita del tessuto e la promozione del recuperodellosviluppo del tessuto cerebrale11, 12,l’alterazione delle risposte immunitarie17e la consegna di terapie derivate da cellule staminali14, 18. Tuttavia, per studiare efficacemente la possibilità di queste applicazioni, è necessario un metodo coerente e riproducibile per indurre l’ictus e iniettare biomateriali. Il modello di corsa PT utilizza tecniche che offrono un controllo preciso sull’orientamento e sulla posizione del tratto. Un laser collegato al dispositivo stereotassico guida gli orientamenti e le pompe collegate ai dispositivi stereotassica controllano la velocità di iniezione del materiale senza la necessità di ulteriori forme di imaging. Pertanto, abbiamo scelto di descrivere i metodi per eseguire un colpo PT nelle cortecce motorie dei topi e per iniettare biomateriali nel nucleo dell’ictus. Qui, utilizziamo idrogel di particelle ricotte microporose (MAP) come biomateriale per iniezione senza cellule aggiunte o fattori di crescita. Inoltre, spieghiamo come recuperare con successo il cervello con biomateriale intatto e discutiamo i saggi di immunochimica utilizzati per analizzare l’esito dell’ictus con e senza iniezione di biomateriali.
Qui dimostriamo un modello di ictus permanente facilmente riproducibile, minimamente invasivo e descriviamo come iniettare un biomateriale nell’infarto cinque giorni dopo l’ictus. L’uso del colorante fototrombotico Rose Bengal e di un laser collimato a 520 nm collegato al dispositivo stereotassico ci dà la possibilità di posizionare il tratto sulla corteccia motoria del mouse con maggiore precisione. Cinque giorni dopo l’ictus, la posizione dell’infarto è visibile a occhio al centro dell’irradiazione, 2,0 mm medio-lat…
The authors have nothing to disclose.
Ci piace riconoscere il National Institutes of Health e il National Institute of Neurological Disorders and Stroke per il finanziamento (R01NS079691).
10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax |
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
Student Adson Forceps -1×2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |