L’AVC est un problème mondial avec des options de traitement minimales et aucune thérapie clinique actuelle pour régénérer le tissu cérébral perdu. Nous décrivons ici des méthodes pour créer un AVC photothrombotique précis dans le cortex moteur des rongeurs et l’injection ultérieure de biomatériaux d’hydrogel pour étudier leurs effets sur la régénération tissulaire après un AVC.
L’AVC est la principale cause d’invalidité et la cinquième cause de décès aux États-Unis. Environ 87% de tous les accidents vasculaires cérébraux sont des accidents vasculaires cérébraux ischémiques et sont définis comme le blocage soudain d’un vaisseau fournissant du sang au cerveau. Dans les minutes qui suivent le blocage, les cellules commencent à mourir et entraînent des lésions tissulaires irréparables. Les traitements thérapeutiques actuels se concentrent sur l’élimination des caillots ou la lyse pour permettre la reperfusion et prévenir des lésions cérébrales plus graves. Bien que la plasticité cérébrale transitoire puisse sauver une partie des tissus endommagés au fil du temps, des fractions importantes de patients se retrouvent avec des déficits neurologiques qui ne disparaîtront jamais. Il y a un manque d’options thérapeutiques pour traiter les déficits neurologiques causés par un ACCIDENT VASCULAIRE CÉRÉBRAL, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles stratégies pour traiter cette population croissante de patients. Les biomatériaux injectables sont actuellement conçus pour améliorer la plasticité cérébrale et améliorer la réparation endogène grâce à l’administration d’agents actifs ou de cellules souches. Une méthode pour tester ces approches consiste à utiliser un modèle d’AVC de rongeur, à injecter le biomatériau dans le noyau de l’AVC et à évaluer la réparation. Connaître l’emplacement précis du noyau de l’AVC est impératif pour le traitement précis après l’AVC, par conséquent, un modèle d’AVC qui aboutit à un emplacement prévisible de l’AVC est préférable pour éviter le besoin d’imagerie avant l’injection. Le protocole suivant couvrira comment induire un accident vasculaire cérébral photothrombotique, comment injecter un hydrogel de manière contrôlée et précise, et comment extraire et cryosectionner le cerveau tout en gardant le biomatériau intact. En outre, nous soulignerons comment ces mêmes matériaux d’hydrogel peuvent être utilisés pour la co-administration de cellules souches. Ce protocole peut être généralisé à l’utilisation d’autres biomatériaux injectables dans le noyau de l’AVC.
L’AVC est la principale cause d’invalidité et la cinquième cause de décès aux États-Unis1. Environ 87% de tous les accidents vasculaires cérébraux sont ischémiques, tandis que la majorité des 13% restants sont hémorragiques2. Un AVC ischémique est défini comme le blocage du flux sanguin dans une artère vers le tissu environnant. Cette occlusion entraîne une privation d’oxygène et une nécrose subséquente qui entraîne souvent une invalidité permanente chez les patients survivants. Bien qu’il y ait eu une diminution du taux de mortalité des accidents vasculaires cérébraux3,sa prévalence devrait augmenter pour atteindre 3,4 millions de personnes d’ici 20304. Cette augmentation du nombre de survivants handicapés et le fardeau économique qui en résulte ont conduit à une poussée pour la recherche sur les accidents vasculaires cérébraux qui se concentre sur les mécanismes de réparation neuronale. Après un AVC, il y a une période inflammatoire qui conduit à la formation d’une cicatrice qui empêche la région nécrotique de se développer. La région entourant le noyau nécrotique est appelée « péri-infarctus » et il existe des preuves solides que la plasticité dans cette région, qui comprend une augmentation de l’angiogenèse, de la neurogenèse et de la germination axonale, est directement liée à la récupération observée chez les modèles animaux et les humains5. Comme il n’existe pas de modèles in vitro capables de reproduire correctement les interactions complexes qui suivent un AVC, les modèles animaux sont essentiels pour la recherche sur l’AVC.
Il existe plusieurs modèles in vivo qui peuvent être utilisés pour produire un AVC ischémique. L’un des modèles les plus couramment utilisés chez la souris est l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, ou MCAo, par occlusion distale ou proximale (via un filament intra-artériel). Le modèle proximal, également connu sous le nom de filament MCAo (fMCAo), entraîne généralement de grands accidents vasculaires cérébraux ischémiques qui englobent de 5% à 50% de l’hémisphère cérébral, en fonction du nombre de facteurs6. Dans ces modèles, une suture ou un filament est avancé de l’artère carotide interne à la base de l’artère cérébrale moyenne (ACM) et maintenu en place pendant une période de temps spécifique. Cette méthode d’occlusion, qui peut être rendue temporaire ou permanente, produit un infarctus centré dans le striatum et peut ou non impliquer une sus-couche du cortex6. La taille de la course résultante est très variable et des techniques d’imagerie, telles que le doppler laser, sont nécessaires pour confirmer l’efficacité de la procédure chez chaque souris. L’occlusion de filament intra-artérielle ou intra-luminale qui dure plus de 30 minutes produit des traits à l’extrémité la plus large de la plage de taille. Certains chercheurs se sont concentrés sur des temps d’occlusion de filament plus courts, ce qui nécessite une mise au point expérimentale substantielle et une validation en laboratoire7. Les modèles de filament MCAo chez la souris suivent des stades similaires de mort cellulaire, de progression ischémique et de formation d’une région de péri-infarctus comme on le voit dans les cas d’accident vasculaire cérébral humain; cependant, les accidents vasculaires cérébraux plus importants ressemblent davantage à l’état pathologique des infarctus cérébraux malins, qui sont moins fréquents, moins traitables accidents vasculaires cérébraux humains6. Pendant ce temps, l’occlusion distale de MCA nécessite une chirurgie et une craniectomie plus impliquées. Dans ce modèle, la partie distale du MCA qui longe la surface du cerveau est directement obstruée par une attache de suture ou une cautérisation. Dans certaines variantes de la technique, les artères carotides sont obstruées unilatéralement ou transitoirement-bilatéralement. Un avantage du MCAo distal est qu’il produit une course corticale de taille moins variable que le modèle de filament. Cependant, le modèle distal produit un rendement comportemental plus faible en raison de la transsection de l’artère carotide externe (ECA), ce qui est également une préoccupation avec fMCAo6.
Un modèle d’AVC alternatif connu pour être moins invasif est le modèle photothrombotique (PT). Le modèle PT donne un emplacement bien défini de l’ischémie et est associé à un taux de survie élevé8. La technique repose sur un colorant photosensible injecté par voie intrapéritonéale qui permet la photo-oxydation intravasculaire simplement en irradiant le tissu désiré avec une lumière ou un laser9. Lors de l’excitation, des radicaux d’oxygène se forment qui causent des dommages endothéliaux, ce qui active l’agrégation plaquettaire et la formation de caillots dans la zone irradiée8,9. Le contrôle étroit de la taille et de l’emplacement de la course, ainsi que la reproductibilité élevée du modèle PT, le rendent idéal pour l’étude des biomatériaux. Bien que la précision soit rendue possible à l’aide d’un laser et de coordonnées stéréotaxiques, certains inconvénients peuvent rendre ce modèle moins idéal pour peu d’études. Contrairement au modèle fMCAo, le modèle PT stroke ne peut pas être réaffûté. Par conséquent, les matériaux pour étudier les agents neuroprotecteurs spécifiques aux dommages après la reperfusion ou les mécanismes suivant la reperfusion ne seraient pas utiles ici8. De plus, en raison de l’insulte microvasculaire du modèle PT, une pénombre ischémique relativement petite est observée. Au lieu de cela, un œdème vasogénique local se produit, ce qui n’est pas caractéristique de l’accident vasculaire cérébral humain, ce qui rend ce modèle indésirable pour les études précliniques sur les médicaments axées sur la zone du péri-infarctus6,8.
L’objectif global des stratégies de biomatériaux dans l’AVC est soit de fournir des agents bioactifs, soit d’agir comme une matrice extracellulaire de substitution pour la croissance des tissus cérébraux. Une stratégie que nous explorerons à l’aide de nos méthodes consiste à administrer de l’hydrogel directement dans le noyau de l’AVC, par opposition au tissu péri-infarctus où de nombreuses thérapies cellulaires actuelles sont administrées10. La raison d’être de cette approche est que l’administration dans le tissu nécrotique trouvé dans le noyau évitera de perturber le tissu sain ou en convalescence environnant. Nous supposons que la diffusion de tous les agents actifs inclus dans le biomatériau pourra atteindre le péri-infarctus à partir du noyau, d’autant plus que nous constatons que la livraison de biomatériaux hydrogel réduit l’épaisseur de la cicatricegliale 11. Ceci est important car il a été démontré que la région du péri-infarctus présente une neuroplasticité après un AVC, ce qui en fait une cible attrayante. En outre, l’administration d’une matrice de substitution au noyau de l’AVC peut être chargée de facteurs angiogéniques12 ou neurogènes13 pour guider la formation de nouveaux tissus, ainsi que de cellules pour l’accouchement14. L’administration cellulaire est grandement améliorée par l’utilisation d’une matrice car elle protège les cellules des forces d’injection sévères et de l’environnement local présents pendant l’accouchement, ainsi que favorise la différenciation et la greffe15.
Ces biomatériaux thérapeutiques injectables ont une pertinence clinique dans les applications d’AVC, car il n’existe actuellement aucune thérapie médicale qui stimule la récupération neuronale après un AVC. Les circuits neuronaux sous-jacents impliqués dans la récupération se trouvent dans le tissu cérébral adjacent au noyau de l’AVC16, tandis que le noyau de l’AVC lui-même est dépourvu de tissu neural viable. Nous prévoyons que l’administration d’un biomatériau dans le noyau de l’AVC nécrotique a le potentiel de stimuler le tissu adjacent vers des processus de régénération par un certain nombre de mécanismes mentionnés précédemment, y compris la libération de dépôt de facteurs de croissance13, la stimulation de la croissance tissulaire et la promotion de la récupération du développement du tissu cérébral11,12, l’altération des réponses immunitaires17, et l’administration de thérapies dérivées de cellules souches14, 18. Cependant, pour étudier efficacement la possibilité de ces applications, une méthode cohérente et reproductible pour induire un AVC et injecter des biomatériaux est nécessaire. Le modèle de course PT utilise des techniques qui offrent un contrôle précis sur l’orientation et l’emplacement de la course. Un laser fixé au dispositif stéréotaxique guide les orientations et des pompes fixées aux dispositifs stéréotaxiques contrôlent le taux d’injection du matériau sans avoir besoin de formes supplémentaires d’imagerie. Par conséquent, nous avons choisi de décrire les méthodes permettant d’effectuer un AVC PT dans les cortex moteurs de souris et d’injecter des biomatériaux dans le noyau de l’AVC. Ici, nous utilisons des hydrogels de particules recuites microporeuses (MAP) comme biomatériau pour injection sans cellules ni facteurs de croissance ajoutés. De plus, nous expliquons comment récupérer avec succès le cerveau avec des biomatériaux intacts et nous discutons des tests d’immunochimie utilisés pour analyser le résultat de l’AVC avec et sans injection de biomatériaux.
Ici, nous démontrons un modèle d’AVC permanent, peu invasif et facilement reproductible et décrivons comment injecter un biomatériau dans l’infarctus cinq jours après l’AVC. L’utilisation du colorant photothrombotique Rose Bengal et d’un laser collimaté de 520 nm connecté au dispositif stéréotaxique nous donne la possibilité de positionner le coup au niveau du cortex moteur de la souris avec une précision accrue. Cinq jours après l’AVC, l’emplacement de l’infarctus est visible à l’œil nu a…
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier les National Institutes of Health et le National Institute of Neurological Disorders and Stroke pour leur financement (R01NS079691).
10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax |
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
Student Adson Forceps -1×2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |