שבץ מוחי הוא בעיה גלובלית עם אפשרויות טיפול מינימליות וללא טיפול קליני נוכחי לחידוש רקמת המוח האבודה. כאן אנו מתארים שיטות ליצירת שבץ פוטותרומבוטי מדויק בקליפת המוח המוטורית של מכרסמים והזרקה מאוחרת יותר של ביו-חומרים הידרוג’ל כדי לחקור את השפעתם על התחדשות רקמות לאחר שבץ.
שבץ מוחי הוא הגורם המוביל לנכות וסיבת המוות החמישית המובילה בארצות הברית. כ -87% מכל השבץ הם שבץ איסכמי ומוגדרים כחסימה פתאומית של כלי המספק דם למוח. בתוך דקות מהחסימה, תאים מתחילים למות וכתוצאה מכך נזק בלתי הפיך לרקמות. הטיפולים הטיפוליים הנוכחיים מתמקדים בהסרת קרישי דם או תמה כדי לאפשר את הרפוי ולמנוע נזק מוחי חמור יותר. למרות פלסטיות מוחית חולפת עשויה להציל חלק מהרקמה הפגועה לאורך זמן, חלקים משמעותיים מהחולים נותרים עם ליקויים נוירולוגיים שלעולם לא ייפתרו. קיים מחסור באפשרויות טיפוליות לטיפול וגירעונות נוירולוגיים הנגרמים על ידי שבץ מוחי, תוך הדגשת הצורך לפתח אסטרטגיות חדשות לטיפול באוכלוסיית המטופלים הגדלה. ביו-חומרים להזרקה מתוכננים כעת כדי לשפר את פלסטיות המוח ולשפר את התיקון אנדוגני באמצעות משלוח של סוכנים פעילים או תאי גזע. שיטה אחת לבדיקת גישות אלה היא להשתמש במודל שבץ מכרסמים, להזריק את הביו-חומרים לליבת השבץ ולהעריך תיקון. לדעת את המיקום המדויק של ליבת השבץ הוא הכרחי לטיפול מדויק לאחר שבץ, ולכן, מודל שבץ התוצאה מיקום שבץ צפוי עדיף כדי למנוע את הצורך בהדמיה לפני הזרקה. הפרוטוקול הבא יכסה כיצד לגרום לשבץ פוטותרומבוטי, כיצד להזריק הידרוג’ל בצורה מבוקרת ומדויקת, וכיצד לחלץ ולהקרין את המוח תוך שמירה על שלמות הביו-חומרים. בנוסף, נוה להדגיש כיצד אותם חומרים הידרוג’ל יכולים לשמש לאספקה משותפת של תאי גזע. פרוטוקול זה יכול להיות כללי לשימוש של ביו-חומרים אחרים להזרקה לתוך ליבת השבץ.
שבץ מוחי הוא הגורם המוביל לנכות וסיבת המוות החמישית המובילה בארצות הברית. כ -87% מכלל השבץ הם איסכמיים, בעוד שרוב 13% הנותרים הם דימומים2. שבץ איסכמי מוגדר כחסימת זרימת הדם בעורק לרקמה שמסביב. חסם זה גורם למחסור בחמצן ונמק לאחר מכן שמוביל לעתים קרובות לנכות קבועה בחולים ששרדו. אמנם חלה ירידה בשיעור התמותה משבץ3, שכיחותו צפויה לגדול ל -3.4 מיליון אנשים עד 20304. עלייה זו בניצולים נכים ונטל כלכלי כתוצאה מכך הובילו לדחיפה למחקר שבץ המתמקד במנגנונים של תיקון עצבי. לאחר שבץ יש תקופה דלקתית שמובילה להיווצרות צלקת המונעת את הרחבת האזור הנמקי. האזור המקיף את הליבה הנמקית מכונה “peri-infarct” ויש ראיות חזקות לכך שהפלסטיות באזור זה, הכוללת אנגיוגנזה מוגברת, נוירוגנזה ונבט אקסוני, קשורה ישירות להתאוששות הנצפית במודלים של בעלי חיים ובני אדם5. מכיוון שאין מודלים במבחנה שיכולים לשכפל כראוי את האינטראקציות המורכבות לאחר שבץ, מודלים של בעלי חיים חיוניים לחקר שבץ.
ישנם מספר דגמי vivo שניתן להשתמש בהם כדי לייצר שבץ איסכמי. אחד המודלים הנפוצים ביותר המשמשים בעכברים הוא חסימה בעורק המוחי האמצעי, או MCAo, באמצעות דיסטלי או פרוקסימלי (באמצעות חוט תוך עורקי) אוחסם. המודל הפרוקסימלי, הידוע גם בשם MCAo חוט (fMCAo), בדרך כלל גורם שבץ איסכמי גדול המקיפים בכל מקום בין 5% ל 50% של חצי הכדור המוחי, תלוי במספר גורמים6. בדגמים אלה, תפר או חוט מתקדם מעורק הראשי הפנימי לבסיס העורק המוחי האמצעי (MCA) ונשמר במקום לפרק זמן מסוים. שיטה זו לחסימה, אשר ניתן נעשה זמני או קבוע, מייצר אוטם כי הוא מרוכז בסטריאטום עשוי או לא יכול להיות כרוך יתר על המידה קליפת המוח6. גודל הקו המתקבל משתנה מאוד, וטכניקות הדמיה, כגון דופלר לייזר, נדרשות כדי לאשר את האפקטיביות של ההליך בכל עכבר. חסימת חוט תוך-עורקי או תוך-זוהר הנמשכת יותר מ-30 דקות מייצרת משיכות בקצה הגדול יותר של טווח הגודל. כמה חוקרים התמקדו בזמני החסימה קצרים יותר של חוטים, הדורשים מיקוד ניסיוני משמעותי ואימותמעבדה 7. מודלים של Filament MCAo בעכברים עוקבים אחר שלבים דומים של מוות תאי, התקדמות איסכמית, ויצירת אזור אוטם פרי כפי שניתן לראות במקרים של שבץ אנושי; עם זאת, השבץ הגדול יותר דומה יותר למצב המחלה של אוטם מוחי ממאיר, שהם פחות נפוצים, פחות ניתן לטיפול שבץ אנושי6. בינתיים, חסם MCA דיסטלי דורש ניתוח מעורב יותר וכת craniectomy. במודל זה, החלק הדיסטלי של MCA העובר לאורך פני השטח של המוח הוא חסם ישירות עם עניבת תפר או צרוב. בווריאציות מסוימות של הטכניקה, עורקי העורק הראשי חסומים באופן חד-צדדי או חולף-דו-צדדי. היתרון של MCAo דיסטלי הוא שהוא מייצר שבץ מבוסס קליפת המוח כי הוא פחות משתנה בגודל מאשר מודל חוט. עם זאת, המודל הדיסטלי מייצר תפוקה התנהגותית ירודה יותר עקב טרנספר של העורק הראשי החיצוני (ECA), שהוא גם דאגה עם fMCAo6.
מודל שבץ חלופי הידוע כפחות פולשני הוא מודל הפוטו-טרומבוטי (PT). מודל PT תוצאות מיקום מוגדר היטב של איסכמיה והוא קשור לשיעור הישרדות גבוה8. הטכניקה מסתמכת על צבע רגיש לאור מוזרק תוך-איפריטונית המאפשר חמצון פוטו-וסקולרי פשוט על ידי הקרנת הרקמה הרצויה עם אור או לייזר9. עם עירור, נוצרים רדיקלים חמצן הגורמים נזק אנדותל, אשר מפעיל צבירה טסיות דם היווצרות קריש באזור מוקרן8,9. השליטה ההדוקה על גודל ומיקום שבץ, כמו גם רבייה גבוהה של מודל PT, עושה את זה אידיאלי עבור לימוד ביו חומרים. בעוד דיוק מתאפשר באמצעות לייזר וקואורדינטות סטריאוטקסיות, ישנם כמה חסרונות שעשויים להפוך את המודל הזה פחות אידיאלי עבור מחקרים מעטים. שלא כמו דגם fMCAo, לא ניתן לשחזר את מודל קו ה-PT. לכן, חומרים לחקירת סוכנים neuroprotective ספציפיים לנזקים לאחר reperfusion או המנגנונים הבאים reperfusion לא יהיה שימושי כאן8. בנוסף, בשל העלבון המיקרווסקולרי של מודל PT, פנומברה איסכמית קטנה יחסית נראית. במקום זאת, בצקת vasogenic המקומי מתרחשת, וזה לא אופייני לשבץ אנושי, מה שהופך את המודל הזה לא רצוי עבור מחקרי סמים פרה קליניים התמקד באזור peri-אוטם6,8.
המטרה הכוללת של אסטרטגיות ביו-חומרים בשבץ היא לספק סוכנים ביו-אקטיביים או לשמש כמטריצה חוץ-תאית תחליף לצמיחת רקמת המוח. אסטרטגיה אחת שנחקור באמצעות השיטות שלנו היא לספק הידרוג’ל ישירות לתוך ליבת השבץ, בניגוד לרקמת peri-אוטם שבו טיפולים רבים בתא הנוכחי מועברים10. הרציונל לגישה זו הוא כי משלוח לתוך הרקמה הנמקית שנמצאה בליבה תימנע משיבוש הרקמה הבריאה או המתאוששת שמסביב. אנו מניחים דיפוזיה של כל סוכנים פעילים הכלולים בתוך biomaterial יוכל להגיע peri-אוטם מן הליבה, במיוחד מאז אנו מוצאים כי משלוח של biomaterials הידרוג’ל מפחית את עובי צלקת גליה11. זה חשוב מאז אזור אוטם פרי הוכח להפגין neuroplasticity לאחר שבץ, מה שהופך אותו למטרה אטרקטיבית. יתר על כן, משלוח של מטריצה פונדקאית לליבת השבץ יכול להיות טעון עם אנגיוגניים12 או neurogenic13 גורמים כדי להנחות את היווצרות של רקמה חדשה, כמו גם תאים עבור המסירה14. משלוח תאים משופר מאוד באמצעות מטריצה מכיוון שהוא מגן על תאים מפני כוחות ההזרקה הקשים והסביבה המקומית הקיימת במהלך המסירה, כמו גם מעודד בידול וחריטה15.
אלה biomaterials טיפולי להזרקה יש רלוונטיות קלינית ביישומי שבץ, כמו אין כרגע טיפולים רפואיים הממריצים התאוששות עצבית לאחר שבץ. המעגלים העצביים הבסיסיים המעורבים בהתאוששות נמצאים ברקמת המוח הסמוכה לליבת השבץ16, בעוד שליבת השבץ עצמה נטולת רקמה עצבית בת קיימא. אנו צופים כי אספקת biomaterial לתוך ליבת שבץ נמק יש פוטנציאל לעורר את הרקמה הסמוכה לקראת תהליכים רגנרטיביים באמצעות מספר מנגנונים שהוזכרו קודם לכן, כולל שחרור מחסן של גורמי גדילה13, גירוי של רקמה בצמיחה וקידום של התפתחות רקמת המוחמתאוששת 11,12, שינוי של תגובות חיסוניות17, ואספקה של טיפולים שמקורם בתאי גזע14, 18. עם זאת, כדי ללמוד ביעילות את האפשרות של יישומים אלה, שיטה עקבית לשחזור עבור גרימת שבץ והזרקת ביו חומרים. מודל קו PT משתמש בטכניקות המציעות שליטה מדויקת על הכיוון והמיקום של הקו. לייזר המחובר למכשיר הסטריאוטקסי מנחה כיוונים, ומשאבות המחוברות למכשירים הסטריאוטקסיים שולטות בקצב ההזרקה של החומר ללא צורך בצורות נוספות של הדמיה. לכן, בחרנו לתאר את השיטות לביצוע שבץ PT בקליפת המוח המוטורית של עכברים ולהזרקת ביו-חומרים לליבת השבץ. כאן, אנו משתמשים הידרוג’ל חלקיקים מיקרו-נקבוביים (MAP) כמו biomaterial להזרקה ללא תאים הוסיף או גורמי גדילה. בנוסף, אנו מסבירים כיצד לאחזר בהצלחה את המוח עם ביו-חומרים שלמים, ואנו דנים בתוצאות אימונוכימיה המשמשות לניתוח תוצאת השבץ עם ובלי הזרקה של ביו-חומרים.
כאן אנו מדגימים מודל שבץ קבוע שניתן לשחזור בקלות, זעיר פולשני ומתארים כיצד להזריק ביו-חומרים לאוטם חמישה ימים לאחר השבץ. השימוש בצבע פוטותרומבוטי רוז בנגל ולייזר קולימיציה של 520 ננומטר המחובר למכשיר הסטריאוטקסי מעניק לנו את היכולת למקם את השבץ בקליפת המוח המוטורית של העכבר בדיוק משופר. חמ…
The authors have nothing to disclose.
אנו אוהבים להכיר המכונים הלאומיים לבריאות ואת המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ למימון (R01NS079691).
10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax |
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
Student Adson Forceps -1×2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |