Analisi del metabolismo delle cellule dell'assassino naturale umano
Summary
In questo articolo, descriviamo un metodo per misurare la glicolysi e la respirazione mitocondriale nelle cellule dell’assassino naturale umano primario (NK) isolate dal sangue periferico, a riposo o dopo l’attivazione indotta da IL15. Il protocollo descritto potrebbe essere facilmente esteso alle cellule NK umane primarie attivate da altre citochine o stimoli solubili.
Abstract
Le cellule natural killer (NK) mediano principalmente risposte immunitarie anti-tumorali e anti-virali innate e rispondono a una varietà di citochine e altri stimoli per promuovere la sopravvivenza, la proliferazione cellulare, la produzione di citochine come i programmi di interferone gamma (IFNγ) e/o citotossicità. L’attivazione delle cellule NK mediante stimolazione della citochina richiede un sostanziale ristrutturazione delle vie metaboliche per supportare i loro requisiti bioenergetici e biosintetici. C’è un grande corpo di prove che suggerisce che il metabolismo delle cellule NK alterato è associato a una serie di malattie croniche tra cui l’obesità e il cancro, che evidenzia l’importanza clinica della disponibilità di un metodo per determinare il metabolismo delle cellule NK. Qui descriviamo l’uso di un analizzatore di flusso extracellulare, una piattaforma che consente misurazioni in tempo reale del consumo di glicolisi e ossigeno mitocondriale, come strumento per monitorare i cambiamenti nel metabolismo energetico delle cellule NK umane. Il metodo qui descritto consente anche il monitoraggio dei cambiamenti metabolici dopo la stimolazione delle cellule NK con citochine come IL-15, un sistema attualmente in fase di studio in una vasta gamma di studi clinici.
Introduction
Le cellule Natural Killer (NK) sono linfociti innati che mediano risposte anti-tumorali e anti-virali. Le cellule NK comprendono il 5-15% di tutti i linfociti nel sangue periferico umano e possono essere trovate anche nella milza, nel fegato, nel midollo osseo e nei linfonodi. Le cellule NK non esprimono recettori polimorfici clonotipici, come i recettori delle cellule T (TCR) o i recettori delle cellule B (BCR). Al contrario, l’attivazione delle loro funzioni citolitiche è stimolata dall’impegno di recettori che riconoscono liganti invariabili sulla superficie di una cella bersaglio1,2.
Le cellule NK umane a riposo isolate dal sangue periferico possono sopravvivere per diversi giorni in una coltura media integrata con siero umano. L’attivazione delle cellule NK da parte di citochine come IL-15 o IL-2 spinge le cellule alla proliferazione e ad un aumento della loro capacità diuccidere, tragli altri effetti 3,4,5. Diversi studi hanno dimostrato una correlazione diretta tra l’attivazione delle cellule NK e i cambiamenti nella loro attivitàmetabolica 6. Questi cambiamenti metabolici sono destinati a soddisfare i particolari requisiti delle cellule in termini di energia e biosintesi.
Le cellule e gli organismi aerobici ottengono energia attraverso una serie di reazioni chimiche che coinvolgono il catabolismo e l’ossidazione di carboidrati, grassi e proteine. Attraverso una combinazione di glicolisi, ciclo di acido tricarboxylico (TCA) e fosforilazione ossidativa, le cellule eucariotiche soddisfano la maggior parte della loro domanda ATP e ottengono gli intermedi necessari come elementi costitutivi per le macromolecole essenziali per la crescita e la proliferazione delle cellule. Il processo di glicolysis (Figura 1A) inizia con l’immissione di glucosio nella cella. Nel citosol, il glucosio viene fosforiato e trasformato in piruvato (con una produzione netta di 2 molecole di ATP per molecola di glucosio), che può essere ridotto a lattato o trasportato nei mitocondri per essere trasformato in Acetil-CoA ed entrare nel ciclo TCA. Il ciclo TCA continua a pedalare alimentato con più molecole di Acetil-CoA e produce CO2 (che alla fine si diffonderà al di fuori della cellula e, reagendo con H2O nel mezzo, genererà acido carbonico che porterà all’acidificazione del mezzo) e NADH, la molecola incaricata di donare elettroni alla catena di trasporto elettronico (ETC). Gli elettroni viaggiano attraverso diversi complessi proteici e sono finalmente accettati dall’ossigeno. Questi complessi (I, III e IV) pompano anche H– dalla matrice mitocondriale nello spazio intermembrana. Come conseguenza del gradiente elettrochimico generato,l’H – entreranno di nuovo nella matrice attraverso il complesso V (ATP-synthase), investendo l’energia potenziale accumulata nella generazione di ATP.
Sia la glicolysis che la respirazione mitocondriale possono essere bloccate in punti diversi utilizzando inibitori. La conoscenza e l’uso di questi inibitori è stata la base per lo sviluppo del flusso extracellulare. Misurando due semplici parametri in tempo reale come il pH e l’ossigeno, l’analizzatore di flusso extracellulare deduce il tasso di glicolysi e respirazione mitocondriale in una piastra a 96 ben. Il test di stress della glicolysi viene eseguito in un mezzo basale senza glucosio (Figura 1B)7. Le prime misurazioni del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) sono indicative dell’acidificazione indipendente dalla glicosisi. Si riferisce come acidificazione non glicolicotica e correla con CO2 prodotto dal TCA che, come spiegato in precedenza, si combina con H2O nel mezzo pergenerare H (ECAR collegato alla TCA). La prima iniezione è glucosio per indurre l’utilizzo del glucosio e aumentare la glicolysis. La seconda iniezione combina sia rotenone, un inibitore I complesso, e antimicina A, un inibitore Complex III insieme, per bloccare l’ETC. Le cellule rispondono a questa drammatica diminuzione della produzione di ATP mitocondriale attivando la glicolysis per mantenere i livelli di ATP cellulare, e questo rappresenta la quantità di glicolisi che non viene utilizzata dalla cellula nello stato basale, ma potrebbe essere potenzialmente reclutata in risposta agli aumenti della domanda di ATP (compensatore). La terza iniezione è il glucosio analogico 2-Deoxyglucose (DG), che compete con il glucosio come substrato per l’esochinasi enzimatica. Il prodotto di questa fosforilazione, 2-deossiglucosio-6-fosfato non può essere trasformato in piruvato, e quindi la glicolysis è bloccata, che abbassa l’ECAR al suo minimo. L’ECAR misurato a questo punto comprende altre fonti di acidificazione extracellulare che non sono attribuite alla glicoolisi o all’attività respiratoria, nonché qualsiasi glicolisi residua non completamente inibita da 2-DG (post 2-DG-acidificazione).
Il test di stress mitocondriale viene eseguito in un mezzo con glucosio (Figura 1C) 8. Le prime misurazioni del tasso di consumo di ossigeno (OCR) corrispondono alla linea di base della respirazione mitocondriale (respirazione basale). La prima iniezione è l’oligomicina, che inibisce il ritorno dei protoni attraverso la sintesi ATP (V complesso), bloccando la sintesi ATP e quindi iperpolarizzare rapidamente la membrana mitocondriale, che impedisce un ulteriore pompaggio di protoni attraverso complessi respiratori e porta ad una diminuzione dell’OCR. Il confronto tra la respirazione di base e il valore dato dall’aggiunta di oligomicina rappresenta la respirazione collegata all’ATP. Il rimanente tasso di consumo di ossigeno insensibile all’oligomicina è chiamato perdita di protoni, che rappresenta il flusso di protoni attraverso il bistrato lipidico o le proteine nella membrana mitocondriale interna come il translocase adenina nucleotide9. La seconda iniezione è il disaccoppiatore 2,4-dinitrophenol (DNP), un ionoforo che induce un ingresso massiccio di H– nella matrice mitocondriale, che porta alla depolarizzazione della membrana mitocondriale e interruzione della sintesi ATP mitocondriale. Le cellule rispondono alla dissipazione della forza protone-motivo aumentando il tasso di trasporto di elettroni e consumo di ossigeno ai livelli massimi nel tentativo inutile di recuperare il potenziale della membrana (capacità respiratoria massima). La differenza tra la capacità respiratoria massima e la respirazione basale è la capacità respiratoria di riserva della cellula, che rappresenta la quantità di respirazione che non viene utilizzata dalla cellula per generare ATP nello stato basale, ma potrebbe essere potenzialmente reclutata in risposta all’aumento della domanda di ATP o in condizioni di stress8. La terza iniezione è una combinazione di rotenone e antimicina A. Questa iniezione ferma completamente l’ETC e l’OCR diminuisce al suo livello più basso, con il consumo rimanente di ossigeno non mitocondriale (causato da NADPH-oxidasi, ecc.).
I cambiamenti nelle vie metaboliche potrebbero in qualche modo prevedere il funzionamento delle cellule NK, in quanto è stato suggerito che l’attivazione continua delle cellule NK con citochine in vitro potrebbe portare all’esaurimento delle cellule NK dallo studio di diverse vie metaboliche10,11. La correlazione tra lo stato metabolico delle cellule NK e la funzione è molto importante dal punto di vista dell’immunoterapia del cancro. In questo campo, l’attivazione di cellule NK con infusione di IL-15, da solo o in combinazione con anticorpi terapeutici monoclonali sono stati testati al fine di migliorare l’uccisione delle cellule tumorali12,13,14. La conoscenza dello stato metabolico delle cellule NK in risposta a queste strategie di trattamento fornirebbe un valido predittore dello stato di attivazione delle cellule NK e della funzione di uccisione.
Lo studio delle vie metaboliche in altre cellule mieloidi e linfoidi come monociti, cellule T e B è statodescritto 15 e sono stati pubblicati metodi ottimizzati16. In questo protocollo forniamo un metodo che combina sia un protocollo di isolamento NK che produce un numero elevato di cellule NK pure e vitali sia un protocollo ottimizzato per misurare l’attività metabolica utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Qui mostriamo che questo è un metodo valido per lo studio dei cambiamenti metabolici nel riposo e IL-15 attivato cellule NK umane. Per il test del flusso extracellulare, sono stati testati e ottimizzati parametri come il numero di cellule e le concentrazioni di farmaci. Rispetto ad altri metodi respirometrici, l’analizzatore di flusso extracellulare è completamente automatizzato e in grado di testare in tempo reale, con quantità molto basse di cellule, fino a 92 campioni contemporaneamente, e quindi consente screening ad alta velocità effettiva (con più campioni e repliche) in modo relativamente rapido17.
Questo metodo può essere utilizzato da ricercatori interessati a valutare la funzione cellulare NK studiando il metabolismo delle cellule NK. Potrebbe essere applicato anche alle cellule attivate da altre citochine, anticorpi o stimoli solubili.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, abbiamo stabilito un protocollo per isolare e cultire in modo efficiente le cellule NK umane primarie pure e vitali dal sangue periferico. Abbiamo anche ottimizzato le condizioni per la misurazione dell’attività metabolica di queste cellule NK valutate dal tasso di consumo di ossigeno e dal tasso di acidificazione extracellulare utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Rispetto ad altri metodi respirometrici, l’analizzatore di flusso extracellulare è veloce, richiede un numero ridotto d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) per il sostegno e la discussione. Questo studio è stato sostenuto dai programmi di ricerca intramurali del National Institutes of Health, National Cancer Institute e National Heart, Lung, and Blood Institute. JT è supportato dal programma Ramon y Cajal (grant RYC2018-026050-I) di MICINN (Spagna).
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | MilliporeSigma | D8375-5G | Glycolyisis stress test injector compound |
| 2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | MilliporeSigma | D198501 | ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound |
| 96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid | Costar | 3799 | NK cell culture |
| Antimycin A | MilliporeSigma | A8674 | Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| BD FACSDIVA Software | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| BD LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive |
| CyQUANT cell proliferation assay | ThermoFisher Scientific | C7026 | Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye |
| EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II | Stemcell technologies | 17851 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Human NK cell Enrichment Kit | Stemcell technologies | 19055 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Magnet | Stemcell technologies | 18001 | NK cell isolation from PBMCs |
| EDTA 0.5 M, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK sell separation buffer |
| FACS tubes | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | Flow cytometry experiment |
| Falcon 50 ml Conical tubes | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK cell separation |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | NK cell separation buffer |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Flow data analysis | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270 | Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK cell stimulation |
| Human serum (HS) | Valley Biomedical | 9C0539 | NK cell culture medium supplement |
| IMDM | Gibco | 12440053 | NK cell culture medium |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | Component of stress test media |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34965 | Viability dye for flow cytometry staining |
| LSM | mpbio | 50494X | PBMCs separation from human blood |
| Mouse anti-human CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T cell flow cytometry staining |
| Mouse anti-human CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK flow cytometry staining |
| Mouse anti-human NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK flow cytometry staining |
| Oligomycin | MilliporeSigma | 75351 | Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK cell separation buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | For determination of protein concentration |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | Cell lysis |
| Rotenone | MilliporeSigma | R8875 | Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| Seahorse Wave Controller Software | Agilent | Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer | |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent | For data analysis | |
| Seahorse XF Base Medium | Agilent | 102353-100 | Extracellular Flux assay base medium |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Extracellular Flux Analyzer | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml). |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S5761 | To prepare the Cell-Tak solution |
| Sodium pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test medium |
Riferimenti
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