Análise do Metabolismo celular assassino natural humano
Summary
Neste artigo, descrevemos um método para medir a glicólise e a respiração mitocondrial em células primárias do Assassino Natural (NK) humanas isoladas do sangue periférico, em repouso ou após a ativação induzida pelo IL15. O protocolo descrito poderia ser facilmente estendido para células NK humanas primárias ativadas por outras citocinas ou estímulos solúveis.
Abstract
As células do Natural Killer (NK) mediam principalmente respostas anti-tumor e imunes antivirais e respondem a uma variedade de citocinas e outros estímulos para promover a sobrevivência, a proliferação celular, a produção de citocinas como os programas de interferon gama (IFNγ) e/ou citotoxicidade. A ativação celular NK por estimulação de citocina requer uma remodelagem substancial das vias metabólicas para suportar seus requisitos bioenergésicos e biossintéticos. Há um grande conjunto de evidências que sugerem que o metabolismo celular NK prejudicado está associado a uma série de doenças crônicas, incluindo obesidade e câncer, o que destaca a importância clínica da disponibilidade de um método para determinar o metabolismo celular NK. Aqui descrevemos o uso de um analisador de fluxo extracelular, uma plataforma que permite medições em tempo real de glicolise e consumo mitocondrial de oxigênio, como uma ferramenta para monitorar mudanças no metabolismo energético das células NK humanas. O método aqui descrito também permite o monitoramento de alterações metabólicas após a estimulação de células NK com citocinas como o IL-15, um sistema que está sendo investigado atualmente em uma ampla gama de ensaios clínicos.
Introduction
As células do Natural Killer (NK) são linfócitos inatos que mediam respostas anti-tumor e antivirais. As células NK compreendem 5-15% de todos os linfócitos no sangue periférico humano, e também podem ser encontradas em baço, fígado, medula óssea e linfonodos. As células NK não expressam receptores clonotípicos polimórficos, como receptores de células T (TCR) ou receptores de células B (BCR). Em contraste, a ativação de suas funções citíticas é motivada pelo engajamento de receptores que reconhecem ligantes invariáveis na superfície de uma célula alvo1,2.
Células NK humanas descansando isoladas do sangue periférico podem sobreviver por vários dias em meio de cultura suplementada com soro humano. A ativação de células NK por citocinas como IL-15 ou IL-2 leva as células à proliferação e ao aumento de sua capacidade de matar, entre outros efeitos3,,4,,5. Vários estudos têm mostrado uma correlação direta entre a ativação celular NK e mudanças em sua atividade metabólica6. Essas alterações metabólicas são destinadas a atender aos requisitos particulares das células em termos de energia e biossíntese.
Células aeróbicas e organismos obtêm energia através de uma série de reações químicas que envolvem o catabolismo e oxidação de carboidratos, gorduras e proteínas. Através de uma combinação de glicólise, o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e a fosforilação oxidativa, as células eucarióticas atendem a maioria de sua demanda ATP e obtêm intermediários necessários como blocos de construção para macromoléculas essenciais para o crescimento e proliferação celular. O processo de glicólise (Figura 1A) começa com a entrada de glicose na célula. No citosol, a glicose é fosforilada e transformada em piruvato (com uma produção líquida de 2 moléculas de ATP por molécula de glicose), que pode ser reduzida a lactato ou transportada para as mitocôndrias para ser transformada em Acetil-CoA e entrar no ciclo TCA. O ciclo TCA continua pedalando abastecido com mais moléculas de Acetil-CoA e produz CO2 (que eventualmente se difundirá fora da célula e, reagindo com H2O no meio, gerará ácido carbônico que levará à acidificação do meio) e NADH, a molécula encarregada de doar elétrons para a cadeia de transporte de elétrons (ETC). Os elétrons viajam através de diferentes complexos proteicos e são finalmente aceitos pelo oxigênio. Esses complexos (I, III e IV) também bombeiam H+ da matriz mitocondrial para o espaço intermembrano. Como consequência do gradiente eletroquímico gerado, o H+ entrará novamente na matriz através do complexo V (ATP-synthase), investindo a energia potencial acumulada na geração de ATP.
Tanto a glicolise quanto a respiração mitocondrial podem ser bloqueadas em diferentes pontos usando inibidores. O conhecimento e o uso desses inibidores foram a base para o desenvolvimento do ensaio de fluxo extracelular. Medindo dois parâmetros simples em tempo real, como pH e oxigênio, o analisador de fluxo extracelular infere a taxa de glicolise e respiração mitocondrial em uma placa de 96 poços. O teste de estresse da glicólise é realizado em um meio basal sem glicose (Figura 1B)7. As primeiras medidas da taxa de acidificação extracelular (ECAR) são indicativas de acidificação independente da glicólise. É referido como acidificação não glicolítico e se correlaciona com o CO2 produzido pelo TCA que, como explicado anteriormente, combina com H2O no meio para gerar H+ (ECAR ligado ao TCA). A primeira injeção é a glicose para induzir a utilização da glicose e aumentar a glicólise. A segunda injeção combina ambos rotenone, um inibidor complexo I, e antimicina A, um inibidor complexo III em conjunto, para bloquear o ETC. As células respondem a essa dramática diminuição na produção de ATP mitocondrial ativando a glicolise para manter os níveis de ATP celular, e isso representa a quantidade de glicólise que não é usada pela célula no estado basal, mas poderia ser potencialmente recrutada em resposta ao aumento da demanda da ATP (glicolycolysis compensatória). A terceira injeção é a glicose analógica 2-Desoxicose (DG), que compete com a glicose como substrato para a enzima hexokinase. O produto desta fosforilação, 2-desoxicosglucose-6-fosfato não pode ser transformado em piruvato, e, portanto, a glicólise é bloqueada, o que reduz o ECAR ao seu mínimo. O ECAR medido neste ponto inclui outras fontes de acidificação extracelular que não são atribuídas à glicólise ou atividade respiratória, bem como qualquer glicolise residual não totalmente inibida pelo 2-DG (pós 2-DG-acidificação).
O teste de estresse mitocondrial é realizado em um meio com glicose (Figura 1C)8. As primeiras medições da taxa de consumo de oxigênio (OCR) correspondem à linha base da respiração mitocondrial (respiração basal). A primeira injeção é a oligomicina, que inibe o retorno de prótons através da sintetizadora ATP (complexa V), bloqueando a síntese de ATP e, assim, hiperpolarizar rapidamente a membrana mitocondrial, que impede o bombeamento de prótons através de complexos respiratórios, e leva a uma diminuição do OCR. A comparação entre a respiração da linha de base e o valor dado pela adição de oligomicina representa a respiração ligada à ATP. A taxa de consumo insensível de oligomicina remanescente é chamada de vazamento de prótons, que representa o fluxo de prótons através do bicamadorão lipídico ou proteínas na membrana mitocondrial interna, como o nucleotídeo de adenina translocase9. A segunda injeção é o uncoupler 2,4-dinitrophenol (DNP), um ionóforo que induz uma entrada maciça de H+ na matriz mitocondrial, o que leva à despolarização da membrana mitocondrial e à interrupção da síntese mitocondrial do ATP. As células respondem à dissipação da força-motivo do próton aumentando a taxa de transporte de elétrons e consumo de oxigênio para níveis máximos em uma tentativa fútil de recuperar o potencial da membrana (capacidade respiratória máxima). A diferença entre a capacidade respiratória máxima e a respiração basal é a capacidade respiratória sobressal da célula, que representa a quantidade de respiração que não é usada pela célula para gerar ATP no estado basal, mas pode ser potencialmente recrutada em resposta ao aumento da demanda de ATP ou sob condições de estresse8. A terceira injeção é uma combinação de rotenona e antimicina A. Esta injeção interrompe completamente o ETC e o OCR diminui para seu nível mais baixo, com o consumo restante de oxigênio sendo não mitocondrial (causado por NADPH-oxidases, etc.).
Mudanças nas vias metabólicas poderiam de alguma forma prever o funcionamento das células NK, como tem sido sugerido que a ativação contínua de células NK com citocinas in vitro poderia levar à exaustão celular NK pelo estudo de diferentes vias metabólicas10,,11. A correlação entre o estado metabólico das células NK e a função é muito importante do ponto de vista da imunoterapia do câncer. Neste campo, a ativação de células NK com infusão de IL-15, isoladamente ou em combinação com anticorpos terapêuticos monoclonais foram testadas a fim de melhorar a morte de células tumorais12,,13,14. O conhecimento do estado metabólico das células NK em resposta a essas estratégias de tratamento forneceria um valioso preditor do status de ativação celular NK e função de morte.
O estudo de vias metabólicas em outras células mieloides e linfoides, como monócitos, células T e B, foi descrito15 e métodos otimizados foram publicados16. Neste protocolo, fornecemos um método que combina tanto um protocolo de isolamento NK que produz altos números de células NK puras e viáveis e um protocolo otimizado para medir a atividade metabólica usando um analisador de fluxo extracelular. Aqui mostramos que este é um método válido para o estudo de alterações metabólicas em repouso e células NK humanas ativadas il-15. Para o ensaio de fluxo extracelular, parâmetros como número de células e concentrações de drogas foram testados e otimizados. Comparado com outros métodos respirométricos, o analisador de fluxo extracelular é totalmente automatizado e capaz de testar em tempo real, com quantidades muito baixas de células, até 92 amostras simultaneamente, e assim permite triagens de alto rendimento (com múltiplas amostras e réplicas) de forma relativamente rápida17.
Este método pode ser usado por pesquisadores interessados em avaliar a função celular NK estudando o metabolismo celular NK. Pode ser aplicado também às células ativadas por outras citocinas, anticorpos ou estímulos solúveis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, estabelecemos um protocolo para isolar e culminar eficientemente células NK humanas primárias puras e viáveis a partir de sangue periférico. Também otimizamos as condições para a medição da atividade metabólica dessas células NK avaliadas pela taxa de consumo de oxigênio e taxa de acidificação extracelular usando um analisador de fluxo extracelular. Comparado com outros métodos respirométricos, o analisador de fluxo extracelular é rápido, requer um pequeno número de células e permite tri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) pelo apoio e discussão. Este estudo foi apoiado pelos Programas de Pesquisa Intramuros dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Câncer e Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue. JT é apoiado pelo programa Ramon y Cajal (grant RYC2018-026050-I) da MICINN (Espanha).
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | MilliporeSigma | D8375-5G | Glycolyisis stress test injector compound |
| 2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | MilliporeSigma | D198501 | ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound |
| 96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid | Costar | 3799 | NK cell culture |
| Antimycin A | MilliporeSigma | A8674 | Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| BD FACSDIVA Software | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| BD LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive |
| CyQUANT cell proliferation assay | ThermoFisher Scientific | C7026 | Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye |
| EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II | Stemcell technologies | 17851 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Human NK cell Enrichment Kit | Stemcell technologies | 19055 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Magnet | Stemcell technologies | 18001 | NK cell isolation from PBMCs |
| EDTA 0.5 M, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK sell separation buffer |
| FACS tubes | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | Flow cytometry experiment |
| Falcon 50 ml Conical tubes | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK cell separation |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | NK cell separation buffer |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Flow data analysis | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270 | Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK cell stimulation |
| Human serum (HS) | Valley Biomedical | 9C0539 | NK cell culture medium supplement |
| IMDM | Gibco | 12440053 | NK cell culture medium |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | Component of stress test media |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34965 | Viability dye for flow cytometry staining |
| LSM | mpbio | 50494X | PBMCs separation from human blood |
| Mouse anti-human CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T cell flow cytometry staining |
| Mouse anti-human CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK flow cytometry staining |
| Mouse anti-human NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK flow cytometry staining |
| Oligomycin | MilliporeSigma | 75351 | Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK cell separation buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | For determination of protein concentration |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | Cell lysis |
| Rotenone | MilliporeSigma | R8875 | Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| Seahorse Wave Controller Software | Agilent | Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer | |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent | For data analysis | |
| Seahorse XF Base Medium | Agilent | 102353-100 | Extracellular Flux assay base medium |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Extracellular Flux Analyzer | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml). |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S5761 | To prepare the Cell-Tak solution |
| Sodium pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test medium |
Riferimenti
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