Production automatisée de neurones corticals et dopaminergiques pluripotents induits par l’homme avec surveillance intégrée des cellules vivantes

Summary

Nous montrons l’automatisation des cultures de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HIPSC) et des différenciations neuronales compatibles avec l’imagerie et l’analyse automatisées.

Abstract

Les protocoles manuels de culture et de différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HIPSC) sont difficiles à normaliser, présentent une grande variabilité et sont sujets à une différenciation spontanée en types de cellules indésirables. Les méthodes sont à forte intensité de main-d’œuvre et ne sont pas facilement accessibles à des expériences à grande échelle. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé un système automatisé de culture cellulaire couplé à un système d’imagerie à haut débit et mis en œuvre des protocoles pour maintenir plusieurs lignes hiPSC en différenciation parallèle et neuronale. Nous décrivons l’automatisation d’un protocole de différenciation à court terme utilisant neurogenin-2 (NGN2) sur-expression pour produire des neurones corticals hiPSC dérivés dans les 6\u20128 jours, et la mise en œuvre d’un protocole de différenciation à long terme pour générer hiPSC dérivés midbrain dopaminergic (mDA) neurones dans les 65 jours. En outre, nous avons appliqué l’approche NGN2 à une petite molécule dérivée des cellules précurseurs neurales (smNPC) transduced avec le lentivirus GFP et a établi un essai automatisé de la prolifération des neurites à cellules vivantes. Nous présentons un système automatisé avec des protocoles adaptés à la culture hiPSC de routine et la différenciation en neurones corticals et dopaminergiques. Notre plate-forme convient à la culture mains libres à long terme et aux produits composés à base de hiPSC à haute teneur/à haut débit, aux dépistages RNAi et CRISPR/Cas9 afin d’identifier de nouveaux mécanismes de la maladie et de nouvelles cibles médicamenteuses.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) s’auto-renouvellent et peuvent se différencier dans presque n’importe quel type de cellule adulte. Ces caractéristiques font de hiPSC un outil utile pour la modélisation des maladies dans la recherche fondamentale et la découverte de^{médicaments 1}. L’iPSC humain conserve l’arrière-plan génétique du donneur qui permet de dériver des types de cellules pertinentes à la maladie qui sont les plus affectés/impliqués dans le cours de la maladie, par exemple, différents sous-types neuronaux pour les maladies neurodégénératives^2,3. En outre, hiPSC surmonte certaines des limitations des modèles animaux et cellulaires de sur-expression en modelant des maladies dans un contexte humain et des niveaux physiologiques d’expression de protéine, et se sont avérés être un atout précieux dans la modélisation des maladies allant des désordres monogéniques, complexes et épigénétiques aussi bien que des maladies de tard-début^4.

Malgré ces avantages et ces possibilités, plusieurs limites de hiPSC doivent encore être abordées. Les protocoles actuels de culture et de différenciation hiPSC ne sont pas rentables, difficiles à normaliser et demandent beaucoup de main-d’œuvre. Les étapes de culture manuelle peuvent entraîner une grande variabilité des rendements et des phénotypes en raison de différences de croissance et de différenciation spontanée du hiPSC. Par conséquent, la variation dépendante des expérimentateurs doit être réduite en mettant en œuvre des techniques de manipulation plus normalisées et en simplifiant les protocoles qui peuvent être réalisés à l’aide de^{l’automatisation 5}. L’établissement de protocoles automatisés de culture et de différenciation hiPSC établira des normes communes pour les projets de recherche universitaire et industrielle, et permettra la génération de modèles de maladies biologiquement pertinents et de résultats plus reproductibles.

Des travaux antérieurs ont tenté d’automatiser les cultures hiPSC^6,7,^8, mais leurs protocoles ont été limités à des formats spécifiques de plaques de culture cellulaire dépendant du système et manquant d’adaptabilité aux différents formats d’analyse. Ces systèmes sont utiles dans le gonflement des cellules, mais peuvent ne pas convenir à la différenciation automatisée dans les types de cellules désirées, phénotypage de la maladie, et les fins de dépistage. En outre, une plate-forme automatisée à grande échelle pour la dérivation du fibroblaste, la génération hiPSC et la différenciation a^{été décrite 9,} mais à une échelle qui ne peut être atteinte que par des laboratoires à haut débit dédiés à la production de lignes qui semble attrayant, mais peut être inabordable pour de nombreux laboratoires universitaires.

Nous avons développé un système de culture cellulaire entièrement automatisé basé sur une station de manutention liquide dans un environnement filtré par air particulaire à haut rendement (HEPA) en conjonction avec un incubateur de CO_{2 de grande} capacité, un cytomètre d’imagerie à champ lumineux et un bras robotique pour le transport des plaques. Ces composants fournissent la base d’une culture et d’une différenciation hiPSC stables et reproductibles. Nous avons complété le système avec un système automatisé de stockage de -20 °C pour le stockage composé ou virus et un imageur confocal à cellules vivantes à disque de filature à grande vitesse. Des protocoles personnalisés ont été générés permettant l’ensemencement automatisé des cellules, les changements de médias, les vérifications des confluences, l’expansion cellulaire et la production de plaques d’analyse avec le traitement de l’échantillon et l’imagerie des plaques, ce qui rend le système compatible avec les criblages à haute teneur/à haut débit. Le système automatisé de culture cellulaire et d’imagerie est exploité à l’aide du logiciel de contrôle et de l’interface utilisateur graphique (GUI) sur mesure. L’interface graphique permet aux utilisateurs d’importer des fichiers CSV contenant des paramètres spécifiques à la ligne cellulaire nécessaires à l’exécution de la méthode. En outre, l’interface graphique permet de planifier de nombreuses expériences dans n’importe quelle séquence en utilisant la vue de calendrier intégrée permettant ainsi le plein contrôle de l’heure à partir de chaque méthode.

Notre système automatisé de culture cellulaire utilise des vitesses normalisées de pipetage, des temps de passage, des seuils de confluence, des densités d’ensemencement et des volumes moyens avec la souplesse nécessaire pour la culture des cellules dans une variété de formats de plaques (format de plaques de 96, 48, 24, 12, 6 ou 1 puits). Nous avons adapté un protocole de différenciation à court terme récemment publié pour convertir hiPSC en neurones qui peuvent produire tubb3 neurones positifs en 6^{jours 10,11}. Nous avons également établi la différenciation automatisée et l’imagerie des cellules précurseurs neuronales de petites molécules (smNPC) en neurones exprimant constitutivement GFP sous le promoteur EF1a¹² et iPSC dans les neurones dopaminergiques midbrain (mDA), en adaptant un protocole d’inhibition dual-SMAD^{précédemment publié 13} qui donne des neurones mDA dans les 65 jours.

Protocol

1. Procédures de base pour automatiser les cultures cellulaires et l’imagerie

1. Charger de nouvelles plaques et astuces de culture
   1. Ouvrez l’interface graphique et cliquez sur le bouton d’afficher le processus ressource/instrument. Pour exécuter n’importe quel processus de ressources/instruments, sélectionnez le processus ressource/instrument et cliquez sur le bouton de processus Run Instrument.
   2. Exécutez le processus de ressources RunHepaHood and Reloading (voir l’étape 1.1.1). Ouvrez la porte, chargez les plaques de culture cellulaire et les conseils jetables dans la position correspondante comme indiqué dans l’image pop-up sur le PC de contrôle.
   3. Essuyez la porte avec 70% d’éthanol pour la décontamination et fermez-la. Exécuter le processus d’instrument Décontamination à partir de l’interface graphique (voir l’étape 1.1.1). Le système est stérilisé par rayonnement UV pendant 30 min.
2. Remblayer les supports culturels et/ou dissocier le reagent
   1. Exécutez l’étape de l’instrument RunHepahood (voir l’étape 1.1.1). Ouvrez la porte d’entrée de la station de manutention liquide. Décontaminer les réservoirs (contenant des supports, du PBS et/ou du reagent de dissociation) avec 70 % d’éthanol et les placer sur le pont au positon assigné (tel que défini dans le fichier cfg.csv). Dé-couvercle des réservoirs.
   2. Décontaminer la porte avec 70% d’éthanol et la fermer. Éduffez le capot HEPA en exécutant le processus de ressources/instruments « InitHepaHood » à partir de l’INTERFACE.
3. Créer une nouvelle « ligne cellulaire » et un nouveau projet dans l’interface graphique
   1. Créez/modifiez les fichiers « Ligne cellulaire » définis par l’utilisateur composés des fichiers Config (*.cfg.csv), de l’importation (*.imp.csv), de la ressource (*.rsv.csv) et du flux de travail (*.wfl.csv).
   2. Ouvrez l’interface graphique et créez une nouvelle « ligne cellulaire » en cliquant sur le bouton Ajouter la ligne cellulaire dans la vue « Éditeur de ligne cellulaire ». Un assistant s’ouvre lorsque le fichier Config doit être sélectionné et qu’un nom de projet avec une courte description doit être saisi.
   3. Naviguez à travers cet assistant à l’aide de la pointe de flèche verte et de confirmer les paramètres en cliquant sur le checkmark vert. Créez un nouveau projet pour la « ligne cellulaire » générée en cliquant sur le bouton Ajouter le projet.
   4. Entrez le nom et la description d’un projet et définissez une couleur de projet qui sera visible dans la vue calendrier de l’INTERFACE GRAPHIQUE. Accédez à la page suivante de l’assistant en cliquant sur la pointe des flèches.
   5. Créez un nouveau lot en cliquant sur le bouton Ajouter le lot et en donnant un nom et une description courts dans la fenêtre contexturée. Sélectionnez toutes les étapes du processus et planifiez l’heure de début pour chacune des étapes du processus. Fermez la fenêtre en cliquant sur OK.
4. Exécuter une méthode automatisée à l’aide de l’interface graphique
   1. Consultez la vue calendrier de l’interface graphique et cliquez sur le bouton Ajouter l’étape du processus.
   2. Sélectionnez la ligne Cellule et après avoir naviavié vers la page suivante de l’assistant choisissez le projet. Marquez le lot à utiliser et cliquez sur la pointe de flèche pointant vers la droite. Selon la méthode utilisée, les lots doivent être vides (pour recevoir de nouvelles plaques), ou contenir des plaques de culture ou des plaques d’essai (tous les autres processus).
   3. Accédez à la page suivante de l’assistant et sélectionnez l’étape de processus qui doit être exécutée. Allez à la dernière page de cet assistant et planifiez l’expérience. Dans la section « Paramètres détails » variables qui sont nécessaires pour exécuter la méthode peut être modifié. Confirmer en cliquant sur OK.
5. Chargement des plaques de culture et d’analyse dans l’incubateur de CO₂
   REMARQUE : Les plaques de 1 puits sont définies comme des plaques de culture puisqu’elles sont couramment utilisées pour les cellules en vrac. Toutes les plaques multi-puits sont définies comme des plaques d’analyse.
   1. Exécutez le processus d’instrument « RunHepaHood » à partir de l’interface graphique tel que décrit à l’étape 1.1.1. et ouvrez la porte devant le bras robotique.
   2. Essuyez le fond des plaques d’analyse avec 70 % d’éthanol et un tissu sans peluche si les plaques sont chargées pour l’imagerie automatisée. Placez des assiettes de culture ou d’analyse sur l’étagère gauche. Assurez-vous que l’orientation de la plaque est correcte. Pour les plaques d’essai, eh bien A1 doit pointer vers le bras robotique tandis que les bords des plaques de culture doivent pointer vers la droite.
   3. Essuyez la porte avec 70% d’éthanol pour la décontamination et fermez-la.
   4. Exécuter la méthode « Chargement des plaques de culture » pour l’importation de plaques de 1 puits ou de « chargement de plaques d’analyse » pour l’importation de plaques multi-puits décrites à l’étape 1.4. Utilisez un lot vide pour exécuter les deux méthodes. Si des codes à barres de plaque sont déjà présents dans ce lot, désélectionnez-les en cliquant sur les cases à cocher.
   5. Transportez des plaques individuelles de l’étagère à la_{plate-forme d’incubateur de} CO 2 à l’aide du bras robotique. La station de navette intégrée récupère la plaque et les stocke dans l’un des racks de l’incubateur de CO_2. Les cellules sont maintenues à 37 °C et 5 % de CO₂.
6. Déchargement des plaques de l’incubateur de CO₂
   1. Exécuter la méthode « Décharger les plaques » (voir l’étape 1.4). Sélectionnez le lot contenant les plaques qui doivent être exportées. Les plaques individuelles peuvent être sélectionnées par leurs codes à barres.
   2. Transportez les plaques de l’incubateur de CO_{2 vers} l’étagère gauche à l’aide du bras robotique.
   3. Démarrez le capot HEPA en utilisant le processus d’instrument « RunHepaHood » tel que décrit à l’étape 1.1.1. et ouvrez la porte devant le bras robotique. Retirez les plaques, décontaminez la porte avec 70% d’éthanol avant de la fermer et d’alimenter le capot HEPA.

2. Protocoles d’automatisation

1. Ensemencement des plaques à partir de tubes
   1. Démarrez le capot HEPA en exécutant le processus d’instrument RunHepaHood (voir l’étape 1.1.1). Ouvrez la porte devant la station de manutention liquide. Entrez le tube de 50 mL contenant la suspension cellulaire et dé-couvercle du tube.
   2. Ouvrez la porte devant le bras robotique et chargez les plaques de culture enduites pour recevoir les cellules sur l’étagère. Décontaminer et fermer les deux portes. Exécuter la méthode « Ensemencement des plaques à partir de tubes » (voir étape 1.4).
   3. Comptez les cellules du cytomètre d’imagerie à champ lumineux à l’aide de la fonction de comptage direct des cellules. Pour le comptage cellulaire, utilisez 16 puits comme répliques dans un format de plaque de 384 puits.
   4. Transportez la plaque de comptage de 384 puits du pont jusqu’au cytomètre d’imagerie à champ lumineux via la plaque tournante à l’aide du bras robotique et commencez le processus d’imagerie. Le cytomètre détermine automatiquement le numéro de cellule par millilitre. Ramenez la plaque de comptage à sa position d’origine à l’aide du bras robotique.
   5. Transportez une culture enduite ou une plaque d’essai de l’étagère jusqu’au pont de pipetage à l’aide du bras robotique. Retirez les cellules de revêtement et de graines dans le nombre défini par l’utilisateur et le volume approprié au format de la plaque (voir le tableau 1). Déplacez la plaque vers le shaker sur le pont pendant 10 s à 500 tours pour la distribution cellulaire et transférez-la à l’incubateur de CO_2.
2. Évaluation automatisée des confluences
   1. Exécutez la méthode « Vérifiez la confluence » décrite à l’étape 1.4. Sélectionnez un lot qui contient au moins une plaque de culture et pas de plaques d’analyse. Dans la section « Détails des paramètres », entrez « iPSCf_2020 » pour les paramètres d’acquisition d’images et d’analyse d’imagerie.
   2. Transportez la première plaque de l’incubateur de CO₂ au cytomètre d’imagerie à champ lumineux via la plaque tournante à l’aide du bras robotique.
   3. Effectuer l’imagerie des cellules dans le cytomètre d’imagerie brightfield pour la vérification des confluences des colonies hiPSC. Utilisez l’application « confluence » et l’image 13 champs de la pate 1 puits et calculez automatiquement la zone moyenne occupée par les cellules.
   4. Transportez la plaque vers l’incubateur de CO₂ à l’aide du bras robotique. Répétez les étapes 2.2.2. à 2,2,4. pour les plaques restantes.
3. Changement médiatique des plaques de culture ou des plaques d’essai
   1. Exécutez la méthode « Media Change Of Culture Plates » décrite à l’étape 1.4. et sélectionnez un lot contenant uniquement des plaques de culture. Définissez la variable indiquant si des pointes ou des aiguilles sont utilisées pour les étapes de pipetage dans la section « Détails des paramètres ». Pour le changement de média de n’importe quelle plaque multi-puits, exécutez la méthode « Changement médiatique des plaques d’analyse » et sélectionnez un lot contenant des plaques d’analyse.
   2. Transportez les plaques individuelles de l’incubateur de CO₂ jusqu’au pont à l’aide du bras robotique et dé-couverclez les plaques. Inclinez automatiquement les plaques et aspirez les vieux supports et jetez-les dans le module de collecte des déchets. Ajouter 12 mL de médias frais. Re-couvercle de la plaque et de transporter les plaques de retour à l’incubateur de CO₂ en utilisant le bras robotique.
4. Subcultivation
   REMARQUE : Exécutez le processus d’instrument « RunHepaHood » à partir de l’interface graphique tel que décrit dans 1.1.1. et ouvrez la porte d’entrée de la station de manutention liquide. Chargez les supports et le réaccente de dissociation aux positions requises (voir l’étape 1.2). Si les pourboires doivent être remplis, utilisez le « rechargement » tel que décrit à l’étape 1.1. Entrez un tube de 50 mL pour recevoir la suspension cellulaire et dé-couvercle du tube.
   1. Exécutez la méthode « Subcultivation des cellules adhérentes » (voir l’étape 1.4). Sélectionnez le lot contenant des plaques de culture qui ont besoin d’être subcultivées.
   2. Transportez les plaques de l’incubateur de CO₂ jusqu’au pont à l’aide du bras robotique et dé-couverclez les plaques. Inclinez automatiquement les plaques et retirez les vieux supports et jetez-les dans le module de collecte des déchets. Laver les cellules une fois avec 8 mL de PBS. Ajouter 8 mL de 0,5 mM EDTA pour le passage à base d’agglutination. Incuber sur le pont pendant 8 min.
   3. Retirez la solution EDTA des plaques et jetez-la dans le module de collecte des déchets. Ajouter 12 mL de milieu frais et transporter les assiettes au shaker. Agiter à 2000 rpm pendant 1 min pour déloger les colonies.
   4. Triturer la suspension cellulaire pendant cinq cycles de pipetage pour briser les colonies iPSC en une plus petite taille (~50\u201280 μm). Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 mL sur le pont. Les cellules de semence automatiquement comme décrit dans l’étape 2.1.5 utilisant un rapport divisé de 1 sur 7.
      REMARQUE : Passage facultatif à une seule cellule. Générer une suspension à cellule unique à l’aide d’un réaccente de dissociation cellulaire unique (voir tableau des matériaux). Au lieu de 0,5 mM EDTA à l’étape 2.4.2., utilisez 8 mL de réagent de dissociation cellulaire unique et incuber pendant 20 min à 37 °C. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 50 mL et ajouter un volume égal de supports. La dissociation à l’aide du reagent de dissociation à cellule unique nécessite une étape manuelle pour pelleter les cellules. Cellules centrifugeuses à 300 x g pendant 3 min. Retirer le surnatant et réutiliser la pastille cellulaire dans 12 mL du média requis et procéder à l’ensemencement des plaques à partir de tubes (voir l’étape 2.1). Compléter les médias avec 2 μM thiazovivine le jour de l’ensemencement lors de l’utilisation de la suspension à cellule unique des hiPSCs.
5. Imagerie automatisée à haute teneur et à haut débit
   REMARQUE : Le paramètre de mesure doit être disponible (voir fichier supplémentaire 1: étape 1.1). Les plaques d’analyse à l’image sont disponibles dans l’incubateur.
   1. Exécuter la méthode « Imagerie » (voir l’étape 1.4). Sélectionnez un lot qui contient au moins une plaque d’analyse et aucune plaque de culture. Dans la section « Paramètres détails », entrez le type de plaque, les définitions de plaque (pour les plaques d’imagerie standard de 96 puits: « Plaque-96-20170918113842 ») et le nom du réglage de mesure.
   2. Transportez la plaque d’essai via la plaque tournante jusqu’au microscope confocal automatisé à l’aide du bras robotique pour démarrer le processus d’imagerie. Récupérez la plaque à l’extrémité de l’imagerie du microscope et transportez-la vers l’incubateur de CO_2. Répétez le processus des plaques restantes dans le lot.

3. Maintenance automatisée et expansion de hiPSC

1. La séquence des vérifications automatisées de la confluence, des changements de médias et de la subcultivation
   1. Cellules de graines sur des plaques de 1 puits utilisant la méthode « Ensemencement des plaques à partir de tubes » (voir l’étape 2.1). Vous pouvez également importer manuellement des plaques de 1 puits ensemencées selon la méthode du « chargement des plaques de culture » (voir l’étape 1.5).
   2. Planifier des vérifications automatisées de la confluence quotidiennement pour surveiller la croissance des colonies du premier au jour 6 de la culture pour l’iPSC (voir l’étape 2.2).
   3. Actualisez les médias tous les deux jours en utilisant la méthode du « changement médiatique des plaques de culture » (voir l’étape 2.3). 12 mL de milieu est utilisé par plaque.
   4. Le jour 6, commencez le processus de « subcultivation » (voir l’étape 2.4.).

4. Différenciation automatisée

1. IPSC humain aux neurones corticals NGN2
   REMARQUE : Préparation manuelle hiPSC. Le protocole implique une surexpériation de NGN2 à l’aide de vecteurs lentiviraux pour la livraison. Transduce hiPSC avec NGN2 à rTTA3 lentivirus dans un rapport de 1:2 (> ~10⁷ TU/mL). Les cellules sont ensuite sélectionnées pour un passage avec de la puromycine de 0,5 μg/mL. Un protocole détaillé pour générer des lignes hiPSC-NGN2 stables se trouve dans le fichier supplémentaire 1: étape 2.
   1. Procéder au processus de « subcultivation » tel que décrit à l’aide du réaccente de dissociation à cellule unique décrit dans la note de l’étape 2.4.4. quand hiPSC atteindre 70\u201280% confluency
   2. Retirer le supernatant et résuspendre la pastille cellulaire dans 12 mL de NGN2 media (Table of Materials) contenant 2,5 μg/mL de doxycycline (dox) et 2 μM de thiazovivine.
   3. Commencez la différenciation à l’aide de la méthode « Ensemencementdes plaques à partir de tubes » (voir l’étape 2.1). Réglez la densité d’ensemencement désirée de l’iPSC à 30 000/cm² (voir le tableau 1). L’iPSC est plaqué sur des plaques pré-enduites avec 0,1 mg/mL poly-L-ornithine (PLO) et 5 μg/mL de laminine.
      REMARQUE : Les plaques de 1 puits sont préférées pour les études à base d’ARN et de protéomique, tandis que le format de plaque de 96 puits est préféré pour les expériences d’imagerie. D’autres formats de plaques d’analyse tels que des plaques de 48, 24, 12 ou 6 puits peuvent également être utilisés.
   4. Le premier jour de différenciation, Actualisez les médias à l’aide du « changement médiatique des plaques d’analyse (voir l’étape 2.3) à l’aide du support NGN2, complété avec 2,5 μg/mL dox et 10 μM N-[2S-(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl-glycine, 1,1-dimethylethyl ester (DAPT). Continuez avec les changements de médias tous les 2\u20123 jours jusqu’au jour désiré de différenciation (voir l’étape 2.3).
   5. Le jour 4 de la différenciation, effectuer un autre changement de médias (voir étape 2.3.) en utilisant NGN2 moyen complété par 10 ng / mL cerveau dérivé facteur neurotrophique (BDNF), 10 ng / mL glial cellule dérivée facteur neurotrophique (GDNF) et 10 ng / mL facteur neurotrophique 3 (NT-3) pour améliorer la maturation. À la fin de l’expérience, exporter les plaques de culture du système pour des expériences en aval (voir l’étape 1.6).
2. Petites molécules cellules précurseurs neuronales (smNPC) aux neurones NGN2
   REMARQUE : Dérivez smNPC suivant la version adaptée du protocole^{publié 12} (voir Fichier supplémentaire 1: étape 5). Modifier le smNPC avec le virus NGN2 et rTTA3 (voir Fichier supplémentaire 1: étape 2). Une ronde de transduction NGN2 et rTTA est suffisante pour générer une population stable. Modifier davantage smNPC avec le lentivirus pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 permettant d’effectuer une surveillance des cellules vivantes. Une multiplicité d’infection (MOI) de 10 est employée pour la transduction lentiviral de GFP.
   1. Passage smNPC sur l’atteinte de la confluence à l’aide d’un reagent de dissociation à cellule unique tel que décrit à l’étape 2.4. Note.
   2. Cellules de semence utilisant le système automatisé de culture cellulaire à une densité cellulaire de 50.000/cm^{2 utilisant} la méthode « Ensemencement des plaques à partir de tubes » (voir étape 2.1.) sur les plaques pré-enduites avec 0,1 mg/mL PLO, et 5 μg/mL laminine dans le milieu NGN2 complété avec 2,5 μg/mL dox.
   3. Le jour 3, effectuez un changement de support (voir l’étape 1.3.) à l’aide d’un support NGN2 frais contenant 2,5 μg/mL dox et 10 μM DAPT. Après le jour 3, effectuez des changements de médias tous les trois jours avec un support NGN2 frais contenant 2,5 μg/mL dox, BDNF, GDNF et NT-3 à 10 ng/mL chacun.
   4. Cellules d’image quotidiennes utilisant la méthode « Imagerie automatisée à haute teneur et à haut débit » (voir l’étape 2.5) pour surveiller l’état de différenciation à l’aide du GFP comme lecture pour la prolifération des neurites. Réglez la puissance laser à 80% et utilisez un temps d’exposition de 30 ms. Acquérir un grand nombre de champs (p. ex., 25 champs) à l’aide de l’objectif 20x.
3. Analyse d’image par lots
   1. Effectuez l’analyse d’image avec le logiciel d’analyse d’image 1, en utilisant le modèle de croissance neurite.
   2. Ouvrez le logiciel. Sélectionnez l’option « Données » et parcourez le dossier de données d’imagerie, cliquez sur ok pour charger les données à analyser. Cliquez sur ouvrir et à partir de la barre de menu supérieure, sélectionnez le protocole et à partir du menu d’application sélectionnez la croissance neurite. Allez aux « algorithmes » et utilisez le canal « 488 » pour définir le noyau, le corps cellulaire et le neurite. Ajustez les paramètres du seuil pour chacun d’eux.
   3. Sélectionnez les puits à utiliser pour l’analyse d’images. En bas à droite, cliquez sur le lien et sélectionnez les entités à analyser telles que la moyenne du nombre de cellules, le total total de la longueur totale du squelette. Procéder à une « pré-analyse » suivie d’un « aperçu ».
   4. Vérifiez si les paramètres d’aperçu sont acceptables et démarrez l’analyse en mode lot. Les résultats sont disponibles dans le dossier parent sous « rapports » dans .csv format de fichier qui peut être ouvert en excel.
      REMARQUE : Le script d’analyse d’image est disponible sur demande.
   5. Longueur moyenne de neurite de parcelle obtenue par longueur totale de neurite normalisée au nombre de cellules.

5. Différenciation automatisée de hiPSC en neurones dopaminergiques midbrain (mDA)

1. Préparation manuelle hiPSC
   1. Dissocier 70\u201280% confluent hiPSC en cellules individuelles à l’aide du réapprovisionnement de dissociation à cellule unique. En bref, incuber les cellules avec un seul réagenciente de dissociation cellulaire (100 μL/cm²⁾pendant 30 min à 37 °C, recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique, centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min et résuspendre les granulés cellulaires dans le milieu de culture iPSC.
   2. Graine 200 000 cellules/cm^{2 sur} des plaques extracellulaires enduire de 1 puits et milieu de culture iPSC complété par 10 μM Y-27632. Cellules de culture du jour au lendemain à 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Différenciation automatisée : Phase 1
   1. Préparez le système de culture automatisé tel que décrit à l’étape 1.1\u20121.2.
   2. Chargez les plaques de culture contenant des cellules dans_{l’incubateur de} CO 2 du système de culture automatisé (voir étape 1.5).
   3. Préparer le milieu KSR (voir tableau des matériaux)et compléter avec de petites molécules (voir le tableau 2)nécessaires pour commencer le jour 0 de différenciation. N’utilisez que des supports fraîchement préparés avec de petites molécules et des facteurs de croissance.
   4. Effectuez des changements médiatiques des plaques de culture tel que décrit à l’étape 2.3 les jours 0 et 1 de différenciation, puis tous les deux jours jusqu’au jour 25.
   5. À partir du jour 5, déplacez graduellement la formulation des médias comme décrit en détail dans le tableau 3.
   6. Le jour 11, ajouter mDA neurone différenciation moyen complété par CHIR (jusqu’au jour 13), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 et DAPT (voir le tableau des matériaux).
   7. Le jour 25, décharger les plaques (voir l’étape 1.6.)
3. Replaquement manuel 1
   1. Dissocier les précurseurs du jour 25 mDA en cellules individuelles à l’aide du réaccente de dissociation à cellule unique. En bref, incuber les cellules avec un seul réagenciateur de dissociation cellulaire (100 μL/cm²⁾pendant 40 min à 37 °C, recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique, centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min et résuspendre la pastille cellulaire dans le milieu de différenciation des neurones mDA.
   2. Graine 400 000 cellules/cm² dans des plaques de culture 1 puits pré-enduites de 0,1 mg/mL PLO, 10 μg/mL de laminine et 2 μg/mL de fibronectine dans le milieu de différenciation des neurones mDA complétés par 10 μM Y-27632 (jusqu’au jour 26) et de petites molécules et facteurs de croissance décrits dans le tableau 2. Cellules de culture du jour au lendemain à 37 °C et 5 % de CO₂.
4. Différenciation automatisée : Phase 2
   1. Plaques de culture de charge contenant des neurones mDA dans l’incubateur de CO₂ du système de culture automatisé tel que décrit à l’étape 1.5
   2. Préparer le milieu de différenciation des neurones mDA (voir tableau des matériaux)et compléter par de petites molécules et les facteurs de croissance nécessaires à la différenciation finale à partir du jour 26 (voir le tableau 2).
   3. Effectuez des changements médiatiques des plaques de culture tel que décrit à l’étape 2.3 le jour 26 de la différenciation, puis tous les 3\u20124 jours jusqu’au jour 65.
      REMARQUE : À des fins d’imagerie à haut débit, il est recommandé de replater les neurones mDA dans des plaques de 96 puits à faible densité le jour 32 de différenciation, tel que décrit à l’étape 5.5.
5. Replating manuel 2
   1. Déchargez les plaques de culture telles que décrites à l’étape 1.6. Dissocier les neurones de jour 32 mDA en cellules simples tel que décrit à l’étape 5.3.1.
   2. Graine 100 000 cellules/cm^{2 dans} des plaques de 96 puits pré-enrobées de 0,1 mg/mL PLO, 10 μg/mL de laminine et 2 μg/mL de fibronectine dans le milieu de différenciation des neurones mDA complétée par 10 μM Y-27632 (jusqu’au jour 33) et de petites molécules et facteurs de croissance (voir tableau 2). Cellules de culture du jour au lendemain à 37 °C et 5 % de CO₂.
   3. Le jour 33, remplacez le milieu par le milieu fraîchement préparé de différenciation de neurones de DA complété par de petites molécules et des facteurs de croissance (sans Y-27632). Changez manuellement tous les 3\u20124 jours jusqu’au jour 65.

6. Immunostaining, acquisition et analyse automatisées d’images à haut débit

1. Coloration de fluorescence
   1. Effectuer l’immunostaining fluorescent tel que décrit dans le fichier supplémentaire 1: étape 4.
   2. Cellules d’image décrites dans le fichier supplémentaire 1: étape 1.2.
   3. Téléchargez les fichiers d’imagerie générés par le système d’imagerie vers le logiciel d’analyse d’images 2 (voir tableau des matériaux)pour une analyse plus poussée de l’image, tel que décrit à l’étape 6.2.
2. Analyse d’image à l’aide du logiciel d’analyse d’image 2
   1. Une fois que les fichiers d’imagerie sont téléchargés dans le logiciel d’analyse d’images 2, passez à la fonction « analyse d’image » et construisez l’algorithme d’analyse en utilisant le menu drop down.
   2. Sélectionnez les noyaux à l’aide de la tâche « trouver des noyaux », qui détecte les régions sur l’image appartenant à des noyaux cellulaires (ici tachés avec Hoechst). Exclure les noyaux des cellules mortes (noyaux pyknotiques) en fixant un seuil pour la zone ou le diamètre nucléaires.
   3. Sélectionnez le cytoplasme cellulaire à l’aide de la tâche « trouver le cytoplasme ». Cette tâche détecte les régions autour des noyaux appartenant au cytoplasme cellulaire. N’incluez que les cellules bien segmentées. Exclure les cellules mitotiques, apoptotiques et mal segmentées. Retirez les cellules qui touchent la bordure de l’image.
   4. Ajoutez les tâches « calculer les propriétés de morphologie » et « calculer les propriétés d’intensité ». Les paramètres de morphologie incluent le calcul des propriétés morphologiques telles que la zone pour une région d’intérêt. Les paramètres d’intensité comprennent le calcul des propriétés d’intensité telles que l’intensité moyenne d’une région d’intérêt (p. ex. cytoplasme des neurones).
   5. Sélectionnez une sous-population (p. ex., neurones positifs au TH) de la population d’intrants (tous les cytoplasmes sélectionnés) en utilisant une ou plusieurs conditions, morphologie et/ou intensité.
      REMARQUE : Habituellement, l’intensité est choisie pour les neurones. Sur la base de contrôles négatifs, il est possible de définir au-dessus de quel seuil d’intensité les neurones sont considérés comme positifs pour th.
   6. Définissez les résultats de sortie. Il s’agit du dernier bloc de construction de chaque analyse. Il définit les valeurs de lecture d’analyse pour chaque puits d’une plaque de culture (résultats par puits).
   7. Exécutez l’analyse des lots et exportez les résultats. Normaliser le nombre de cellules positives au nombre total de noyaux et représenter les données comme le pourcentage de cellules positives.

7. Réaction quantitative en chaîne de polymése en temps réel (qRT-PCR)

1. Effectuez le protocole qRT-PCR tel que décrit dans le fichier supplémentaire 1: étape 3.

Representative Results

Notre système automatisé de culture cellulaire et d’imagerie a été conçu pour minimiser l’intervention humaine nous permettant de normaliser la culture de hiPSC et la différenciation en différents types de cellules telles que les neurones dopaminergiques corticals ou midbrain (mDA). Une vue d’ensemble schématique de notre système automatisé de culture cellulaire avec des dispositifs d’imagerie intégrés est décrite à la figure 1. L’introduction initiale de cultures cellulaires dans ce système automatisé de culture cellulaire peut être faite soit en ensemencement automatique des cellules à partir d’un tube de 50 mL, soit en utilisant la méthode de « chargement des plaques de culture » ou de « chargement des plaques d’essai » pour l’importation de plaques de culture ou d’essai. Un élément central de notre système est la station de manutention liquide où toutes les étapes de transfert liquide telles que les changements de médias ou les subcultivations sont effectuées. La disposition sur mesure du gestionnaire liquide est représentée à la figure 2. La station de manutention liquide est équipée de quatre positions. Jusqu’à quatre plaques peuvent être transférées de l’incubateur au pont, ce qui permet des changements de supports parallèles. Étant donné que dans la méthode de subcultivation, les plaques de culture parent et fille doivent être logées sur le pont, le nombre maximal de plaques de culture traitées en parallèle est limité à deux. Une caractéristique importante de la station de manutention liquide est la possibilité d’incliner les plaques pendant le changement de média pour l’enlèvement complet de la culture cellulaire supernatant. En outre, la station de manutention liquide est équipée de shakers pour favoriser la dissociation enzymatique des cellules lors de l’exécution du protocole de subcultivation. Notre système de culture automatisé est également équipé de deux systèmes d’imagerie : un cytomètre d’imagerie à champ lumineux pour effectuer des vérifications de comptage cellulaire et de confluence et, par conséquent, le suivi de la croissance cellulaire au fil du temps, et un microscope confocal à double disque rotatif pour l’imagerie rapide, haute teneur et haute résolution des cellules.

Les cultures hiPSC sont surveillées quotidiennement pour la croissance au cytomètre d’imagerie brightfield et analysées pour le pourcentage de confluence. L’image brillante dans le panneau gauche et dans le panneau droit un masque vert de l’analyse de l’image brightfield obtenu avec le cytomètre (Figure 3A). Une croissance homogène du hiPSC est observée au fil du temps, comme le montrent les pourcentages de confluence de deux lignées hiPSC (n = 4 plaques) cultivées en parallèle et soumises à des vérifications de confluence du jour 1 au jour 6 (figure 3B). Lorsqu’il atteint le seuil fixé, le hiPSC est adopté. Les lignées cellulaires ont été cultivés manuellement (m) ou par le système d’automatisation (a) et observées pour le maintien de la morphologie typique des cellules souches pendant au moins deux passages, images représentatives de champs lumineux (figure 4A). Le hiPSC cultivé manuellement (non montré) ou dans le système automatisé présentait le marqueur typique des cellules souches OCT4 (rouge) et SSEA4 (vert), comme le montre l’analyse d’immunofluorescence (figure 4B). L’expression des marqueurs de pluripotence OCT4, NANOG et REX1 a également été évaluée au niveau de l’ARNm par qRT-PCR (Figure 4C). Des quantifications relatives ont été effectuées avec des échantillons prélevés sur une lignée cellulaire cultivée manuellement (m) et dans le système de culture automatisé (a) en doublons (répliques 1 et 2). Les niveaux d’expression des trois marqueurs de pluripotence dans les répliques cultivées dans le système de culture automatisée sont similaires à l’expression des marqueurs après la culture manuelle. Le jour 8 (D8), l’expression des marqueurs de pluripotence était absente dans les neurones corticals différenciés (Diff) de hiPSC.

Une application importante du système de culture automatisé est la différenciation de hiPSC en différents types de cellules, y compris les neurones. Ici, nous montrons la différenciation de hiPSC en neurones en utilisant la stratégie NGN2, qui produit une culture neuronale corticale pure en très peu de temps (environ 6 jours). Les neurones différenciés dans le système de culture automatisé (a) présentaient une morphologie et une organisation neuronale similaires du réseau que les neurones cultivés manuellement (m) (Figure 5A). Les neurones corticals différenciés automatisés étaient positifs pour TUBB3 (neurone spécifique classe III β-tubulin, rouge) et BRN2 (marqueur de couche corticale supérieure, vert) (figure 5B), comparables aux neurones différenciés manuellement (données non montrées). L’expression de marqueurs neuronaux, y compris la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2), la molécule d’adhérence des cellules neurales (NCAM1) et Synapsin-1 (SYN1), ainsi que les marqueurs neuronaux corticals BRN2 et CUX1 (couche corticale supérieure) ont été enrichis en neurones au jour 8 (D8) de différenciation (Figure 5C). Très faible ou aucune expression de ces marqueurs a été observée dans hiPSC. Des quantifications relatives ont été effectuées avec des échantillons prélevés sur une lignée cellulaire cultivée manuellement (m) et dans le système de culture automatisé (a) en doublons (répliques 1 et 2). Les niveaux d’expression dans les répliques montrent des variations similaires entre les différenciations manuelles et automatisées.

La capacité d’imagerie intégrée du système de culture automatisé permet la collecte de données mains libres pour la santé des cultures, permettant ainsi l’acquisition automatisée à long terme de lectures phénotypiques. En utilisant l’approche NGN2 d’une petite molécule dérivée précurseur neuronal (smNPC) ligne transduite avec le lentivirus GFP, nous avons établi une cellule vivante automatique neurite outgrowth assay dans lequel la longueur de neurite a été mesurée sur 11 jours de différenciation sans aucune intervention manuelle. La complexité du neurite a augmenté au fil du temps, comme en témoigne la zone occupée par les neurites les jours 1, 3 et 11, l’expression GFP et les images masquées de l’analyse (Figure 6A, B). L’augmentation de la longueur du neurite du jour 1 à 11 de la différenciation a été quantifiée et a montré un développement similaire à travers différents puits. Par souci de simplicité, les données provenant de seulement 3 colonnes avec 6 puits chacun à partir d’une plaque de 96 puits sont représentées dans le graphique représentatif, bien que tous les 60 puits intérieurs aient été analysés (figure 6C).

Une autre application du système de culture automatisé montré ici est la différenciation de hiPSC en neurones mDA. La différenciation est basée sur les changements de médias à la suite d’un protocole préédité et a été effectuée sur le système de culture automatisé de jours 0 à 65. Les changements de médias automatisés n’ont pas causé de détachement cellulaire ou d’autres changements visuellement détectables dans la différenciation. À la fin de la différenciation, le jour 65, les neurones mDA montrent l’organisation cellulaire et la morphologie (soma sphérique, dendrites longs et épineux) comparables à la différenciation manuelle (Figure 7A, B). Au niveau de l’ARNm, les neurones mDA différenciés dans le système de culture automatisé montrent l’expression des marqueurs neuronaux et mDA, MAP2 et TH (tyrosine hydroxylase), respectivement (figure 7C). Les deux différenciations ont généré des quantités substantielles de neurones positifs TH et MAP2 (Figure 7D).

Figure 1 : Aperçu schématique de la culture cellulaire automatisée et de la plate-forme d’imagerie.
Le système a été conçu avec un boîtier en polycarbonate et deux hottes HEPA (A et B) équipées de quatre lampes UV assurant un environnement stérile pour les applications de culture cellulaire. Les plaques de culture cellulaire sont chargées sur des étagères devant le bras robotique accessible par la porte d’entrée (C). Les plaques sont chargées dans l’incubateur de CO₂ (D) d’une capacité de 456 plaques. Un cytomètre à cellules brillantes (E) est utilisé pour les vérifications de confluence et le comptage cellulaire pendant les routines de subcultivation. La station de manutention liquide est en dessous de l’une des hottes HEPA (B). La disposition du tablier du gestionnaire liquide est décrite à la figure 2. Le bras de pipetage de la station de manutention liquide transporte une tête de pipetage de 96 canaux, huit canaux de pipetage de 1 mL et quatre canaux de pipetage de 5 mL. Dans le cas des canaux de pipetage de 1 mL, des pointes ou des aiguilles peuvent être utilisées pour les transferts liquides. À des fins de criblage, les cellules ensemencées dans des plaques d’analyse peuvent être traitées avec des échantillons stockés à -20 °C dans le système automatisé de stockage de -20 °C (F) après le dégel de ces échantillons dans un deuxième incubateur (G). L’imagerie à haut débit est effectuée au microscope confocal automatisé (H) offrant d’acquérir des images en mode confocal à l’aide de deux disques de filature ou en mode épifluorescence. Une chambre à cellules vivantes intégrée au microscope permet d’effectuer l’imagerie à long terme des cellules de culture. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Disposition du pont de la station de manutention liquide.
Les positions de pointe sont indiquées par « 50 μL » pour les pointes de 50 μL, par « standard » pour les pointes de 300 μL, par « élevé » pour les pointes de 1 mL et par « 5 mL » pour les pointes de 5 mL. Composants de plate-forme : (A) Quatre positions chauffante de shaker (vitesse maximale : 2500 rpm) qui peuvent être employées pour n’importe quelle plaque de culture ou format de plaque d’essai. Les positions du shaker sont équipées de pinces à pinces qui sont également utilisées pour l’alignement des plaques après les transports vers le pont. En outre, les positions du shaker fonctionnent comme une position de stationnement du couvercle pour les plaques pendant les étapes de transfert liquide. À des fins représentatives, toutes les positions des shakers sont occupées par 96 plaques d’analyse. (B) Quatre modules d’inclinaison pour le traitement simultané de quatre plaques de n’importe quel format sont placés sur le dessus. La position la plus basse marque la chambre de collecte des déchets pour les plaques de culture et d’analyse et la tête de pipetage de 96 canaux. À des fins représentatives, tous les modules d’inclinaison sont occupés par des plaques d’analyse de 96 puits. (C) En première position, la plaque de 384 puits pour le comptage cellulaire est située. Voici deux positions pour les plaques qui sont occupées par des plaques de 96 puits à des fins représentatives et un rack pour quatre tubes de 50 mL et quatre tubes de 15 mL. La position la plus basse est occupée par des pointes de 5 mL. (D) Trois lignes de médias avec des positions pour les réservoirs de médias. Les lignes de médias possèdent des capteurs de niveau liquide qui permettent de remplir automatiquement le réservoir multimédia avec jusqu’à 250 mL de supports. (E) Deux modules de déchets liquides avec drain actif sont basés sur le dessus, en dessous d’un module à température contrôlée avec une position pour un récipient (blanc) et un support de pointe de 5 mL sont situés. (F) Cinq positions pour 1 mL conseils. (G) Deux modules à température contrôlée sont placés en bas et une position pour garer un de leurs couvercles sur le dessus. (H) Positions pour deux supports de pointe imbriqués de 50 μL (NTR) en haut, suivies de deux positions pour le ramassage à canal unique et à 96 canaux de 300 bouts de μL et d’un support d’extrémité de 5 mL en bas. (I) Un empileur pour 384 plaques de comptage bien au sommet suivie de trois 300 μL NTR et un rack de pointe de 5 mL au fond. (J) Station de stockage et de lavage pour trois ensembles de huit aiguilles réutilisables en métal de 1 mL. (K) Position des déchets pour les canaux de pipetage de 1 mL et 5 mL et vide NTR (gris) ainsi qu’un bloc de pince pour les canaux de 1 et 5 mL (blanc) utilisés pour les étapes de transport sur le pont. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Vérification automatisée de la confluence de hiPSC.
(A) Images représentatives de champ lumineux (BF) de hiPSC prises par le cytomètre cellulaire (gauche) et après analyse automatisée de la confluence (droite) indiquant la zone proportionnelle occupée par les cellules en vert; (B) Pourcentages de confluence enregistrés à partir de deux lignées hiPSC (iPS #1 et #2) du jour 1 à 6 de la culture, n = 4 plaques de 1 puits par lignée cellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Passage du hiPSC.
(A) Image BF d’une ligne hiPSC cultivée manuellement (à gauche) et utilisant le système de culture automatisé (droite). Des images ont été prises 6 jours après le deuxième passage; (B) Images représentatives de hiPSC tachées pour les marqueurs de pluripotence OCT4 et SSEA4, et contre-tachées avec Hoechst 33342 (Noyaux); (C) Résultats de qRT-PCR pour les marqueurs de pluripotence OCT4, NANOG et REX1 dans une lignée hiPSC cultivée en doublons (1 et 2) manuellement (m) et dans le système de culture automatisé (a), et les neurones corticals dérivés hiPSC respectifs (Diff) au jour 8 (D8) de différenciation. Les données sont représentées comme la quantité relative (QR) en utilisant iPS_a_1 comme échantillon de référence. Les barres d’erreur représentent l’écart type (SD) par rapport à 3 répliques techniques de la réaction qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 et RPLPO ont été utilisés comme gènes d’entretien ménager. Barre d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Neurones corticals dérivés de l’iPSC humain.
(A) Images brightfield du jour 6, manuellement (m) et automatisé (a) neurones corticals différenciés montrant des réseaux neuronaux similaires; (B) Images représentatives de cellules tachées pour TUBB3 (pan neuronal), BRN2 (neurones corticals) et Hoechst 33342 (noyaux) le jour 8 de la différenciation; (C) Résultats de qRT-PCR pour les gènes marqueurs des neurones corticals (MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 et SYN1) enrichis au jour 8 (D8) de différenciation. Les données sont représentées comme la quantité relative (QR) en utilisant iPS_a_1 comme échantillon de référence. Les barres d’erreur représentent le SD à partir de 3 répliques techniques de la réaction qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 et RPLPO ont été utilisés comme gènes d’entretien ménager. Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Essai à haut débit pour l’excroissance de neurite.
(A) Images représentatives de GFP exprimant des cellules les jours 1, 3 et 11 de différenciation; (B) Images binaires représentatives des neurites les jours 1, 3 et 11 de différenciation. La croissance de la neurite a été quantifiée à l’aide du logiciel d’analyse d’images à contenu élevé 1 et est représentée sous forme de longueur de neurite; (B) Le graphique montre l’augmentation de la longueur des neurites dans les neurones NGN2 dérivés du PNJ et la formation d’un réseau dense. Trois plaques de 96 puits avec des cellules dans les 60 puits intérieurs sont photographiées. Par souci de simplicité, seules trois colonnes de puits par plaque de 96 puits sont montrées à titre d’exemple avec n = 6 puits par colonne. En moyenne, 1308 cellules ont été analysées par puits. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard de la moyenne (S.E.M.). Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Neurones mDA dérivés de l’iPSC humain.
Les neurones MIDbrain DA différenciés manuellement (m) et dans le système de culture automatisé (a). (A, B) Images fluorescentes représentatives des neurones mDA tachés pour la tyrosine hydroxylase (TH, marqueur neuronal mDA; vert), MAP2 (marqueur neuronal; rouge) et Hoechst 33342 (noyaux; bleu); (C) Résultats qRT-PCR représentatifs pour les gènes marqueurs des neurones mDA différenciés manuellement et dans le système de culture automatisé. Les niveaux d’expression TH et MAP2 sont représentés comme quantité relative (QR) normalisée par rapport aux gènes d’entretienménager (OAZ1 et GAPDH); (D) Pourcentages de neurones positifs TH et MAP2 générés par la différenciation manuelle et automatisée. Les barres d’erreur représentent le SD de deux différenciations indépendantes réalisées avec deux lignes iPSC distinctes (#1 et #2). Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Type de cellule	But	Étape du protocole	Densité cellulaire	Format de plaque	Numéro de cellule/puits
Différenciation NGN2
Ipsc	NGN2 génération de lignes stables	S.2.3.	30 000 cellules/cm2	12 puits	1,17,000
Ipsc	Différenciation neuronale NGN2	3.1.3.	30 000 cellules/cm2	1-bien	25,20,000
Ipsc	Différenciation neuronale NGN2	3.1.3.	30 000 cellules/cm2	96 puits	9,600
génération smNPC
smNPC (smNPC)	Replaqué les jours 12 et 16	S5.9. et S5.11.	70 000 cellules/cm2	6-bien	6,72,000
smNPC (smNPC)	Replaqué à partir du passage 5	5.11.	50 000 cellules/cm2	6-bien	4,80,000
smNPC (smNPC)	neurones smNPC à NGN2	3.2.2	50 000 cellules/cm2	96 puits	16,000
différenciation mDA
Ipsc	différenciation des neurones mDA	4.1.2.	200 000 cellules/cm2	1-bien	1,68,00,000
Neurones DA	Jour 25 replating	4.3.2.	400 000 cellules/cm2	1-bien	3,36,00,000
Neurones DA	Jour 25 replating	4.5.2.	100 000 cellules/cm2	96 puits	32,000
Revêtement	But	Étape du protocole	Concentration/ Dilution	Format de plaque	Détails du revêtement
Culture iPS
Matrice extracellulaire	iPSC, ligne NGN2, neurones mDA	1.5.7. et S2.3.	1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12	1-/12-bien	8/0,5 mL/puits; 1 h à RT
Différenciation NGN2
Poly-L-Ornithine	Différenciation neuronale NGN2	3.1.3. et 3.2.2.	0,1 mg/mL; Pbs	1-/96-puits	8/0,1 mL/puits; 12 h à 37°C; 3x Lavage PBS
Laminin	Différenciation neuronale NGN2	3.1.3. et 3.2.2.	5 μg/mL; Pbs	1-/96-puits	8/0,1 mL/puits; 4 h à 37°C
génération smNPC
Matrice extracellulaire	génération et culture smNPC	S5.6., S5.9., S5.11.	1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12	6-bien	1 mL; 2 h à RT
différenciation mDA
Matrice extracellulaire	différenciation mDA	4.1.2.	1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12	1-bien	12 mL; 12 h à 37°C
Poly-L-Ornithine	différenciation mDA	4.3.2. et 4.5.2.	0,1 mg/mL; Pbs	1-/96-puits	12/0,1 mL/puits; 12 h à 37°C; 3x Lavage PBS
Laminin	différenciation mDA	4.3.2. et 4.5.2.	10 μg/mL; Pbs	1-/96-puits	12/0,1 mL/puits; 12 h à 37°C
Fibronectine	différenciation mDA	4.3.2. et 4.5.2.	2 μg/mL; Pbs	1-/96-puits	12/0,1 mL/puits; 12 h à 37°C
*Une matrice extracellulaire aliquot est définie comme le facteur de dilution (en μL) présent dans le certificat d’analyse de ce produit.

Tableau 1 : Densité et revêtement des cellules d’ensemencement respectifs au format de la plaque.

Jour	Réactif
Jour 0 - 1	100 nM LDN193189, 10 μM SB431542
Jour 1 - 3	100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mL FGF-8b
Jour 3 - 5	100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mL FGF-8b, 3 μM CHIR99021
Jour 5 - 7	100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mLFGF-8b, 3 μM CHIR99021
Jour 7 - 9	100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021
Jour 9 - 11	100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021
Jour 11 - 13	3 μM CHIR99021, 20 ng/mL BDNF, 0,2 mM L-ascorbic acid (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT
Jour 13 - 65	20 ng/mL BDNF, 0,2 mM D-ascorbic acid (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT

Tableau 2 : Ajout de petites molécules pour la différenciation des neurones dopaminergiques.

Jour	KSR moyen	Moyen N2	Moyen de différenciation
Jour 0 - 1	100%	0	0
Jour 1 - 3	100%	0	0
Jour 3 - 5	100%	0	0
Jour 5 - 7	75%	25%	0
Jour 7 - 9	50%	50%	0
Jour 9 - 11	25%	75%	0
Jour 11 - 13	0	0	100%
Jour 13 - 65	0	0	100%

Tableau 3 : Gradient médiatique pour la différenciation des neurones dopaminergiques.

Dossier supplémentaire 1. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Nous introduisons un système automatisé de culture cellulaire avec des capacités d’imagerie intégrées pour la normalisation de la culture hiPSC et la différenciation neuronale. En raison de l’intervention minimale de l’utilisateur, la variation expérimentale est faible assurant la reproductibilité des phénotypes cellulaires pendant la différenciation. Le calendrier prend en charge l’organisation et la parallélisation des expériences et permet un haut degré de flexibilité au moment où les expériences sont menées. Les méthodes existantes peuvent être facilement adaptées et le spectre des méthodes disponibles peut être augmenté. En outre, un grand nombre de formats de plaques d’essai peuvent être utilisés ajoutant à la flexibilité de ce système. Le système minimal composé d’un incubateur de CO_2, d’un bras robotique, d’un cytomètre à cellules brillantes et d’une station de manutention liquide constitue l’unité de base nécessaire à la culture et à la différenciation hiPSC, avec des coûts abordables pour les laboratoires de recherche universitaires. La combinaison du système automatisé de culture cellulaire avec un système de stockage automatisé de -20 °C pour le stockage des composés, des bibliothèques RNAi ou des bibliothèques CRISPR/Cas9, et l’intégration d’un microscope à haute teneur/à haut débit permettent l’exécution de criblages phénotypiques.

Dans l’étude actuelle, le système automatisé de culture cellulaire utilisait des conseils jetables et les supports culturels étaient remplis manuellement dans le réservoir, limitant ainsi l’utilisation de la station de manutention liquide pour les changements de médias et d’autres processus culturels, surtout du jour au lendemain. Pour contourner cette limitation, les méthodes peuvent être ajustées à l’utilisation d’aiguilles au lieu de conseils jetables et, après avoir installé des connexions de tube entre les lignes de médias et les sacs multimédias stockés dans un réfrigérateur, les réservoirs de médias peuvent être remplis automatiquement avec des supports frais préchauffés par des éléments chauffants. Cela réduirait les interférences des utilisateurs causées par le remplissage manuel des pourboires, des médias culturels et des échanges de réservoirs.

Notre système automatisé de culture cellulaire offre plusieurs avantages. L’un est le système de suivi des codes à barres. Les plaques chargées dans le système sont identifiées par un code à barres unique qui est lu et enregistré par le système permettant le suivi des échantillons pendant et après l’exécution de la méthode. Un autre avantage est la possibilité de créer des projets spécifiques à l’utilisateur. Ici, les plaques de culture chargées dans le système peuvent être attribuées à un projet spécifique et regroupées en lots. La structuration en lots simplifie l’exécution de la même procédure à toutes les plaques d’un certain lot puisqu’aucune plaque individuelle n’a besoin d’être sélectionnée. En outre, un éditeur de classe liquide permet d’ajuster la vitesse et la hauteur de pipetage ainsi que les paramètres d’aspiration et de distribution pour chaque étape de transfert liquide. Chaque processus est documenté dans des fichiers journaux permettant de retracer les tâches qui ont été exécutées pour une culture ou une plaque d’analyse donnée.

Les neurones et autres types de cellules dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HIPSC) sont des outils in vitro utiles pour étudier les mécanismes des maladies neurodégénératives dans des populations de patients spécifiques (p. ex. neurones dopaminergiques pour la maladie de Parkinson) offrant la possibilité de dépistages personnalisés des médicaments. La culture hiPSC est très intensive en temps et exige des personnes formées pour exécuter des protocoles de différenciation complexes, généralement limités à la production à basse échelle. Nous avons adapté la culture sans mangeoire de hiPSC à une culture automatisée et mis en œuvre deux protocoles de différenciation neuronale, un protocole rapide de différenciation corticale des neurones basé sur la surexsation NGN2 sous un promoteur tet-on^10,11, et un protocole à long terme à base de petites molécules pour la génération de neurones dopaminergiques midbrain (mDA)¹³. Le transfert simple et la reproductibilité des protocoles de culture manuelle et de différenciation rendent le système de culture automatisé très utile. L’iPSC humain cultivé dans le système automatisé de culture cellulaire a montré la morphologie cohérente de cellules souches et a exprimé les marqueurs importants de pluripotence, reproductibles entre les expériences indépendantes. En outre, l’automatisation du protocole de culture hiPSC a favorisé la culture et l’expansion d’un plus grand nombre de lignées cellulaires en parallèle. Les vérifications automatisées de la confluence qui devraient être effectuées pendant la nuit ont permis de libérer le système pendant la journée des étapes de processus en aval effectuées lorsque l’utilisateur se trouvait en laboratoire (p. ex., la récolte de cellules ou le replacage manuel pour les différenciations). En atteignant le seuil de confluence défini par l’utilisateur, les cellules sont passages et replacés dans des plaques extracellulaires recouvertes de matrice disponibles sur l’empileur du système automatisé de culture cellulaire. Chaque tour de passage prend environ 70 min et génère quatre plaques d’un puits à partir d’une plaque parente, ce qui se traduit par une capacité de 20 passages par jour.

L’automatisation du protocole de différenciation NGN2 a été effectuée avec succès et a permis la génération d’une population homogène de cellules neuronales à travers différents passages et comparables à des différenciations manuelles. De plus, les coûts expérimentaux des études de dépistage à grande échelle impliquant plusieurs lignées cellulaires ou des expériences de dépistage avec des milliers de conditions/composés d’essai seraient réduits en raison de différenciations rapides. Les readouts rentables et à haut débit, y compris les mesures de la prolifération des neurites à cellules vivantes, peuvent être facilement développés, implémentés et utilisés comme lectures phénotypiques pour la modélisation des maladies, comme^{indiqué précédemment 14,15,16}. Ainsi, nous avons en outre adapté le protocole NGN2 à l’aide de petites molécules dérivées de cellules précurseurs neuronaux (SMNPC) qui constituent constitutivement sur-exprimer GFP. Les cellules smNPC offrent d’autres avantages, y compris la réduction des coûts avec les médias culturels (un tiers du coût avec la culture iPSC) et le temps nécessaire pour intensifier les expériences. Les rendements cellulaires de smNPC sont 7 à 10 fois plus élevés que ceux obtenus avec l’iPSC. Les neurones différeciants ont été surveillés et photographiés avec succès pendant plusieurs jours à l’aide d’un processus d’imagerie entièrement automatisé sans avoir besoin de colorants manuels d’anticorps ou d’étiquetage chimique, ce qui a permis d’économiser les coûts et le temps requis pour les procédures manuelles, y compris l’imagerie par elle-même. L’imagerie actuelle des 60 puits intérieurs d’une plaque de 96 puits prend environ 16 min par plaque lorsque 25 champs par puits sont photographiés, ce qui signifie que les données d’un dépistage à base d’imagerie pour 1000 composés, pourraient être acquises et analysées en une journée. À l’avenir, cette lecture pourrait être utilisée dans des études de dépistage composé pour le sauvetage des défauts de l’excroissance neurite.

En outre, nous démontrons également le transfert d’un protocole manuel de différenciation pour générer des neurones dopaminergiques midbrain (mDA) de l’iPSC. Ce petit protocole de différenciation à base de molécules prend 65 jours et est à forte intensité de main-d’œuvre en raison des multiples étapes de replacage et des changements fréquents des médias, la plupart du temps tous les 2 jours, ce qui limite la production de neurones mDA à quelques lignes iPSC en même temps. Le protocole automatisé de différenciation mDA a le grand avantage d’intensifier la différenciation à des dizaines de lignes iPSC. Jusqu’à 30 lignées cellulaires pourraient être différenciées en parallèle. Puisque la différenciation est principalement basée sur des changements de médias, presque tout le processus de différenciation peut être mené sans interférence humaine. En utilisant le calendrier du système automatisé, nous pourrions planifier les changements de médias en fonction des étapes de différenciation. L’une des limites du travail avec un si grand nombre de lignées cellulaires et de plaques de culture était l’impossibilité d’effectuer des changements médiatiques du jour au lendemain. La raison principale est le fait que notre système est mis en place pour l’utilisation de conseils jetables et le remplissage manuel des supports culturels nécessitant un utilisateur dans le laboratoire pour exécuter cette étape manuelle. Pour faciliter le processus de changement des médias, les plaques chargées dans le système ont été assignées à un projet et regroupées en lots. La taille du lot a ensuite été adaptée au nombre de pourboires jetables et au volume de supports culturels disponibles. Comme nous l’avons vu plus haut, cette limitation peut être facilement surmontée par la mise en œuvre d’aiguilles réutilisables/lavables et le remplissage automatisé des supports. Le passage/replacage automatisé des cellules, comme le montre l’iPSC, est l’une des commodités offertes par notre système automatisé de culture cellulaire. Nous avons testé le replaquement automatisé des neurones mDA le jour 25 de la différenciation. Cependant, la dissociation des neurones mDA nécessite une incubation plus longue (40 min) avec l’enzyme de dissociation que l’iPSC (8 min) prolongeant le processus de replacage automatisé à plus de 1 h par lignée cellulaire. En conséquence, le replacage automatisé de 30 lignes cellulaires dans la même journée est devenu impossible. Accélérer d’autres étapes lors du replacage automatisé (transport des plaques, pipetage) et adapter le système à l’utilisation d’aiguilles et de lignes multimédias qui rendent possible un travail de nuit permettrait de résoudre cette limitation. Malgré les inconvénients, nous pourrions réussir à transférer le protocole manuel à une différenciation automatisée des neurones mDA produisant des cultures avec des quantités substantielles de CELLULES MAP2 (neurones) et TH (neurones mDA).

La différenciation de dizaines de lignées cellulaires iPSC en parallèle est d’un grand intérêt pour les projets qui étudient les mécanismes moléculaires des maladies neurodégénératives, y compris la maladie de Parkinson. Toutefois, accomplir des tâches plus rapidement avec moins d’erreurs et à des coûts réduits est un grand défi. Grâce à l’automatisation des protocoles présentés ici (iPSC, smNPC et mDA neurone), nous pourrions accélérer, réduire les coûts et augmenter la reproductibilité dans nos projets. Le développement de projets comme FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) impliquant des centaines de lignées cellulaires de patients montre la nécessité d’une culture automatisée et de protocoles de différenciation. Nos perspectives futures incluent le transfert de modèles manuels de culture cellulaire tridimensionnelle (3D) au système automatisé. Des adaptations mineures dans les paramètres de définition des plaques et l’utilisation d’adaptateurs permettront l’utilisation de plaques commerciales ou sur mesure et de chambres microfluidiques requises pour les cultures 3D. De plus, la mise en œuvre d’un modèle automatisé d’imagerie sans étiquette nous permettra de suivre la croissance neuronale en temps réel et de traduire les changements dans l’excroissance des neurites, l’organisation des neurones et la mort cellulaire en une meilleure compréhension des mécanismes de la maladie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies	Distributor	Catalog Number	Dilution
iPSC pluripotency marker
Mouse anti-SSEA4	Abcam	ab16287	1 to 33
Rabbit anti-Oct3/4	Abcam	ab19857	1 to 200
NGN2 neuron markers
Mouse anti- TUBB3	R & D	MAB1195	1 to 500
Rabbit anti-BRN2	NEB	12137	1 to 1,000
mDA neuron markers
Chicken anti-TH	Pel-Freez Biologicals	12137	1 to 750
Mouse anti-MAP2	Santa Cruz	sc-74421	1 to 750
Secondary antibodies
Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11039	1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029	1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11032	1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11012	1 to 2,000
Nuclei counterstaining
Hoechest 33342	Invitrogen	H3570	1 to 8,000
Instruments	Distributor	Catalog Number	Description/Application
Agilent TapeStation system	Agilent technologies	4200	Automated electrophoresis for DNA and RNA samples
Automated -20 °C storage system	Hamilton Storage Technologies	Sample Access Manager (SAM -20C, 3200 series)	Storage of reagents
Barcode reader	Honeywell	Barcode Reader Orbit	Barcode scanner
Brightfield cell cytomat	Nexcelom	Celigo	Confluence check and cell counting
CellVoyager 7000	Yokogawa	CellVoyager 7000	Automated confocal microscope
Cytomat for cell cultures	Thermo Fisher Scientific	Cytomat 24 C, CU	12 stackers pitch 28 mm, 12 stackers pitch 23 mm (total of 456 plates)
Cytomat for thawing samples	Thermo Fisher Scientific	Cytomat 2-LIN, 60 DU (Drying Unit)	2 stackers pitch 28 mm (total of 42 plates)
HEPA filters	Hamilton Robotics	Hood Flow Star UV	Modified by Hamilton Robotics
Liquid handling station	Hamilton Robotics	Microlab Star	Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml and 96 Channel MPH
Media reservoir	Hamilton Robotics	188211APE	Media/reagents reservoir
Pure water system	Veolia Water	ELGA PURELAB Classic	Provides pure water for needle wash station
QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	QSTUDIO12KOA	Real-time PCR machine
Robotic arm	Hamilton Robotics	Rackrunner	Transport of plates
Turn table	Hamilton Robotics	Turn Table	Adjust plate orientiation
Uninterruptible power supply	APC	Smart UPS RT Unit, 10000 VA Power supply	Backup power supply
VIAFLO-pipettes	Integra	4500	Electronic pipette
ViiA 7 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4453545	Real-time PCR machine
Materials	Distributor	Catalog Number	Notes
1-well culture plate (84 cm2)	Thermo Fischer Scientific	165218	Nunc OmniTray
6-well culture plates (9.6 cm2)	Greiner Bio-One	657160	TC treated with lid
12-well culture plate (3.9 cm2)	Greiner Bio-One	665180	TC treated with lid
96-well culture plate (0.32 cm2)	Perkin Elmer	6005558	CellCarrier-96 Black plate
Tips, 50-µL	Hamilton Robotics	235987	50-uL tips
Tips, 300-µL	Hamilton Robotics	235985	300-µL tips
Tips, 1000-µL	Hamilton Robotics	235939	1000-µL tips
Tips, 5-mL	Hamilton Robotics	184022	5-mL tips
Tubes, 15-mL	Greiner Bio-One	188271	15-mL tubes
Tubes, 50-mL	Greiner Bio-One	227261	50-mL tubes
Nalgene cryogenic 2.0 mL vials	Sigma Aldrich	V5007	Cryovials
Plasmids	Distributor	Catalog Number	Notes
pLV_hEF1a_rtTA3	Addgene	61472	Kind gift from Ron Weiss
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro	Addgene	61474	Kind gift from Ron Weiss
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus	Takara Bio	631983
Primers	Sequence (forward)	Sequence (reverse)	Source
iPSC pluripotency
OCT4 (ID 4505967a1)	CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG	GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC	PrimerBank
NANOG (ID 153945815c3)	CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA	CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC	PrimerBank
REX1 (ID 89179322c1)	AGAAACGGGCAAAGACAAGAC	GCTGACAGGTTCTATTTCCGC	PrimerBank
NGN2 neurons
MAP2 (ID 87578393c1)	CTCAGCACCGCTAACAGAGG	CATTGGCGCTTCGGACAAG	PrimerBank
BRN2 (ID 380254475c1)	CGGCGGATCAAACTGGGATTT	TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT	PrimerBank
CUX2 (ID 291045458c2)	CGAGACCTCCACACTTCGTG	TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG	PrimerBank
NCAM1 (ID 336285437c3)	TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC	CTCACAGCGATAAGTGCCCTC	PrimerBank
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)	TGCTCAGCAGTACAACGTACC	GACACTTGCGATGTCCTGGAA	PrimerBank
mDA neurons
TH	CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA	CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA	NCBI primer-BLAST
MAP2	GGATCAACGGAGAGCTGAC	TCAGGACTGCTACAGCCTCA	NCBI primer-BLAST
Housekeeping genes
GAPDH	GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG	GAGCCCCAGCCTTCTCCATG	NCBI primer-BLAST
OAZ1	AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT	ATGAAGACATGGTCGGCTCG	NCBI primer-BLAST
RPLPO	CCTCATATCCGGGGGAATGTG	GCAGCAGCTGGCACCTTATTG	NCBI primer-BLAST
RPL13A	GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC	TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC	NCBI primer-BLAST
Media and Reagents	Distributor	Catalog Number	Use concentration
Coating matrix
Extracellular matrix (Matrigel)	Corning	354277	10 μg/mL
Fibronectin	Corning	356008	2 μg/mL
Laminin	Sigma	L2020	5 - 10 μg/mL
Poly-L-Ornithine (PLO)	Sigma	P3655	0.1 mg/mL
Culture media
iPSC culture medium (Essential 8 Flex medium)	Gibco	A2858501
NGN2 neurons - NGN2 medium
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	0.909 mL (50 µM)
B27 supplement	Gibco	12587010	10 mL (1%)
DMEM/F-12, GlutaMAX	Gibco	31331093	484.75 mL
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL ( 2 mM)
Insulin	Sigma	I9278	0.25 mL (2.5 µg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140050	5 mL (0.5%)
N2 supplement	Gibco	17502048	5 mL (0.5%)
Neurobasal medium	Gibco	21103049	485 mL
mDA neurons - SRM medium
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	0.5 mL (55 µM)
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL (2 mM)
Knockout DMEM/F-12	Gibco	12660012	409.5 mL
Knockout serum replacement (serum replacement)	Gibco	10828028	75 mL (15%)
MEM Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140050	5 mL (1%)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	5 mL (1%)
mDA neurons - N2 medium
B27 supplement	Gibco	12587010	10 mL (2%)
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL (2 mM)
N2 supplement	Gibco	17502048	5 mL (1%)
Neurobasal medium	Gibco	21103049	475 mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	5 mL(1%)
mDA neurons - Differentiation medium
B27 supplement	Gibco	12587010	10 mL (2%)
Neurobasal medium	Gibco	21103049	485 mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	5 mL (1%)
NGN2 neurons - Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Peprotech	450-02	10 ng/mL
CHIR99021 (CHIR)	R&D	4423/10	2 μM
Doxycyline (dox)	Sigma	D9891	2.5 μg/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF)	Peprotech	450-10	10 ng/mL
L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (AA2)	Sigma	A8960	64 mg/L
Neurotrophic factor-3 (NT-3)	Peprotech	450-10	10 ng/mL
Purmorphamine (PMA)	Cayman	10009634	0.5 μM
Puromycin	Sigma	P8833-10MG	0.5 μg/mL
Thiazovivin	Merk Millipore	420220-10MG	2 μM
mDA neurons - Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Peprotech	450-02	20 ng/mL
CHIR99021 (CHIR)	R&D	4423/10	3 μM
DAPT	Cayman	13197	10 µM
Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	1 mM
Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b)	Peprotech	100-25	100 ng/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF)	Peprotech	450-10	20 ng/mL
L-ascorbic acid (AA1)	Sigma	A4403	0.2 mM
LDN193189 (LDN)	Cayman	11802	100 nM
Purmorphamine (Purm)	Cayman	10009634	2 μM
Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus (SHH)	R&D	1845-SH	100 ng/mL
SB431542 (SB)	Cayman	13031	10 μM
Transforming Growth Factor type ß3 (TGFß3)	R&D	243-B3	1 ng/mL
Y-27632	Cayman	10005583	10 µM
Dissociation reagents
Single cell dissociation reagent (StemPro Accutase)	Gibco	A1110501	1x
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Gibco	11575020	0.5 mM
RNA isolation and cDNA kit
RNA isolation kit	Qiagen	74106	Rneasy MiniKit
RNA lysis buffer	Thermo Fisher Scientific	15596018	Trizol lysis buffer (RNA lysis buffer)
Reverse transcriptase (kit)	Thermo Fisher Scientific	18080-085	SuperScript III Reverse Transcriptase
Software	Company	Catalog Number	Description/Application
Cell Culture Framework (CCF) (Graphical user interface, GUI)	Hamilton Robotics	Custom-made	User interface for the automated system
CellPathFinder software (image analysis software 1)	Yokogawa	CellPathfinder HCS Software	Image analysis tool
CellVoyager Measurement System	Yokogawa	Included with CellVoyager 7000	Microscope controlling software
Columbus software (image analysis software 2)	Perkin Elmer	Columbus	Image analysis tool
Cloud based qPCR app	Thermo Fisher Scientific	Themo Fisher cloud	Analysis software for qRT-PCR data
Venus software	Hamilton Robotics	VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software	Controlling software for the automated system