Diferenciación de monocitos en macrófagos fenotípicamente distintos después del tratamiento con células madre de sangre de cordón humano (CB-SC)-Exosomas derivados
Summary
La aplicación de exosoma es una herramienta emergente para el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Establecemos un protocolo de aislamiento exosoma con alta pureza para aislar exosomas de nuevas células madre identificadas llamadas CB-SC para estudios mecánicos. También coculuramos exosomas derivados de CB-SC con monocitos humanos, lo que lleva a su diferenciación en macrófagos fenotípicamente distintos.
Abstract
La terapia de educador de células madre (SCE) es un nuevo enfoque clínico para el tratamiento de la diabetes tipo 1 y otras enfermedades autoinmunes. La terapia SCE circula las células mononucleares de la sangre del paciente aislado (por ejemplo, linfocitos y monocitos) a través de una máquina de aféresis, co-cultiva las células mononucleares de sangre del paciente con células madre derivadas de la sangre del cordón umbilical (CB-SC) en el dispositivo SCE, y luego devuelve estas células inmunitarias “educadas” a la sangre del paciente. Los exosomas son vesículas extracelulares de tamaño nanonúlgubre entre 30o u2012150 nm existentes en todos los medios de cultivo de biofluidos y células. Para explorar más a fondo los mecanismos moleculares subyacentes a la terapia SCE y determinar las acciones de los exosomas liberados de CB-SC, investigamos qué células fagocitan estos exosomas durante el tratamiento con CB-SC. Al co-cultivar exosomas derivados de CB-SC con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), descubrimos que los exosomas derivados de CB-SC eran tomados predominantemente por monocitos humanos CD14 positivos, lo que llevó a la diferenciación de los monocitos en macrófagos tipo 2 (M2), con morfología similar a un husillo y la expresión de marcadores de superficie moleculares asociados a M2. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y caracterización de exosomas derivados de CB-SC y el protocolo para la cocultura de exosomas derivados de CB-SC con monocitos humanos y el monitoreo de la diferenciación M2.
Introduction
Las células madre de la sangre del cordón umbilical (CB-SC) son un tipo único de células madre identificadas a partir de la sangre del cordón umbilical humano y se distinguen de otros tipos conocidos de células madre como las células madre mesenquimales (MSC) y las células madre hematopoyéticas (HSC)1. Basándonos en sus propiedades únicas de modulación inmune y su capacidad para adherirnos firmemente a la superficie de los platos petri, desarrollamos una nueva tecnología designada como terapia de educador de células madre (SCE) en ensayos clínicos2,3. Durante el tratamiento con SCE, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un paciente se recogen y distribuyen a través de un separador celular y se co-cultivan con CB-SC adherente in vitro. Estas células “educadas” (PBMC tratada con CB-SC) se devuelven a la circulación del paciente en un sistema de bucle cerrado. Los ensayos clínicos ya han demostrado la seguridad clínica y eficacia del tratamiento SCE para el tratamiento de enfermedades autoinmunes como la diabetes tipo 1 (T1D)2,4 y la alopecia areata (AA)5.
Los exosomas son una familia de nanopartículas con diámetros que oscilan entre los 30o u2012150 nm y existen en todos los medios de cultivo de biofluidos y células6. Los exosomas están enriquecidos con muchas moléculas bioactivas, incluyendo lípidos, ARNm, proteínas y microRNAs (miRNA), y desempeñan un papel importante en las comunicaciones de célula a célula. En los últimos tiempos, los exosomas se han vuelto más atractivos para los investigadores y las compañías farmacéuticas debido a su potencial terapéutico en las clínicas7,8,9. Recientemente, nuestros estudios mecánicos demostraron que los exosomas liberados por CB-SC contribuyen a la modulación inmune de la terapia SCE10.
Aquí, describimos el protocolo para explorar el mecanismo de la terapia SCE dirigida a monocitos por exosomas liberados por CB-SC. En primer lugar, los exosomas liberados por CB-SC se aislaron de los medios condicionados derivados de CB-SC utilizando métodos de ultracentrifugación y se validaron mediante citometría de flujo, mancha occidental (WB) y dispersión dinámica de luz (DLS). En segundo lugar, los exosomas derivados de CB-SC fueron etiquetados con un tinte lipofílico fluorescente verde: Dio. En tercer lugar, se co-cultivaron con PBMC para examinar los porcentajes positivos de exosomas derivados de CB-SC con etiqueta dioda en las diferentes subpoblaciones de PBMC por citometría de flujo. Este protocolo proporciona orientación para estudiar la acción de los exosomas subyacentes a la modulación inmune de las células madre.
Protocol
Representative Results
Discussion
La aplicación de exosomas es un campo emergente para el diagnóstico clínico, el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Aquí, presentamos un protocolo detallado sobre la preparación de exosomas derivados de CB-SC y el estudio funcional de exosomas sobre la diferenciación de monocitos humanos. El protocolo actual demostró que los exosomas funcionales derivados de CB-SC están aislados por centrifugación secuencial y ultracentrifugación con alta pureza y que exhiben la modulación inmune en monocitos.<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Sr. Poddar y al Sr. Ludwig por el generoso apoyo de fondos a través de la Fundación Hackensack UMC. Agradecemos a Laura Zhao por la edición en inglés.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
Riferimenti
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicina. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
