Monositlerin İnsan Kordon Kan Kök Hücresi (CB-SC)-Türetilmiş Ekzozomlar Ile Tedavi Sonrası Fenotipik Farklı Makrofajlara Farklılaşması
Summary
Ekzozom uygulaması ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp için ortaya çıkan bir araçtır. Mekanistik çalışmalar için CB-SC adı verilen yeni tanımlanmış kök hücrelerden ekzozomları izole etmek için yüksek saflıkta bir ekzozom izolasyon protokolü uyguluyoruz. Ayrıca insan monositleri ile CB-SC kaynaklı ekzozomlar, fenotipik farklı makrofajlar içine farklılaşmayol eşkültür.
Abstract
Kök Hücre Eğitimcisi (SCE) tedavisi tip 1 diyabet ve diğer otoimmün hastalıkların tedavisinde yeni bir klinik yaklaşımdır. SCE tedavisi izole hastanın kan mononükleer hücreleri (örneğin, lenfositler ve monositler) bir aferez makinesi aracılığıyla dolaşır, eş-kültürler hastanın kan mononükleer hücreleri yapışık kordon kanı kaynaklı kök hücreleri ile (CB-SC) SCE cihaz, ve daha sonra hastanın kan bu “eğitimli” bağışıklık hücreleri döndürür. Ekzozomlar tüm biyosıvı ve hücre kültürü ortamlarında bulunan 30\u2012150 nm arasında nano boyutlu ekstrasellüler veziküllerdir. SCE tedavisinin altında yatan moleküler mekanizmaları daha fazla araştırmak ve CB-SC’den salınan ekzozomların hareketlerini belirlemek için, CB-SC ile tedavi sırasında hangi hücrelerin bu ekzozomları fagositize olduğunu araştırıyoruz. Dio-SC kaynaklı ekzozomları insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) ile birlikte örerek, CB-SC türetilmiş ekzozomların ağırlıklı olarak insan CD14-pozitif monositler tarafından alındığını ve monositlerin tip 2 makrofajlara (M2) farklılaşmasına yol açarak, mil benzeri morfolojisi ve M2 ile ilişkili yüzey lerinin ifadesinin alındığını bulduk. Burada CB-SC kaynaklı ekzozomların izolasyonu ve karakterizasyonu için bir protokol ve CB-SC kaynaklı ekzozomların insan monositleri ile birlikte kültürü ve M2 farklılaşmasının izlenmesi için protokol saklı yız.
Introduction
Kordon kanı kök hücreleri (CB-SC) insan kordon kanı ndan tanımlanan kök hücrelerin benzersiz türüdür ve mezenkimal kök hücreler (MSC) ve hematopoetik kök hücreler (HSC)1gibi kök hücrelerin diğer bilinen tiplerinden ayırt edilir. Bağışıklık modülasyonu ve sıkıca Petri yemekleri yüzeyine uymak için yeteneklerini kendi benzersiz özellikleri dayanarak, biz klinik çalışmalarda Kök Hücre Eğitimci (SCE) tedavisi olarak belirlenen yeni bir teknoloji geliştirdi2,3. SCE tedavisi sırasında hastanın periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) toplanır ve bir hücre ayırıcısı aracılığıyla dolaşıma sokularak yapışık CB-SC in vitro ile birlikte kültürlenir. Bu “eğitimli” hücreler (CB-SC-tedavi PBMC) daha sonra kapalı döngü sistemi içinde hastanın dolaşımına döndürülür. Klinik çalışmalar zaten tip 1 diyabet (T1D)2,4 ve alopesi areata (AA)5dahil olmak üzere otoimmün hastalıkların tedavisi için SCE tedavisinin klinik güvenlik ve etkinliğini göstermiştir .
Ekzozomlar çapları 30\u2012150 nm arasında değişen nano tanecikleri bir aile ve tüm biyoakışkan ve hücre kültürü medya6var. Ekzozomlar lipidler, mRNA’lar, proteinler ve mikroRNA’lar (miRNA) dahil olmak üzere birçok biyoaktif molekülle zenginleşir ve hücre-hücre iletişiminde önemli bir rol oynarlar. Geç, ekzozomlar kliniklerde tedavi potansiyelleri nedeniyle araştırmacılar ve ilaç şirketleri için daha cazip hale gelmiştir7,8,9. Son zamanlarda, bizim mekanistik çalışmalar CB-SC yayımlanan ekzozomlar SCE tedavisinin bağışıklık modülasyonu katkıda gösterdi10.
Burada, CB-SC’de serbest bırakılan ekzozomlar tarafından monositleri hedefleyen SCE tedavisinin mekanizmasını araştırmak için protokolü açıklıyoruz. İlk olarak, CB-SC’den serbest bırakılan ekzozomlar ultrasantrifüj yöntemleri kullanılarak CB-SC kaynaklı klimalı ortamdan izole edildi ve akış sitometrisi, western blot (WB) ve dinamik ışık saçılımı (DLS) ile doğrulandı. İkinci olarak, CB-SC türetilmiş ekzozomlar yeşil floresan lipophilic boya ile etiketlendi: Dio. Üçüncü olarak, akış sitometrisi ile PBMC’nin farklı alt popülasyonlarında Dio etiketli CB-SC türetilmiş ekzozomların pozitif yüzdelerini incelemek için PBMC ile birlikte kültürlendiler. Bu protokol, kök hücrelerin immün modülasyonunun altında yatan ekzozomların eylemini incelemek için rehberlik sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ekzozomların uygulanması klinik tanı, ilaç gelişmeleri ve rejeneratif tıp için ortaya çıkan bir alandır. Burada CB-SC türetilmiş ekzozomların hazırlanması ve insan monositlerinin farklılaşması üzerine ekzozomların fonksiyonel çalışması ile ilgili ayrıntılı bir protokol saklıyız. Mevcut protokol, fonksiyonel CB-SC türetilmiş ekzozomların sıralı santrifüj ve yüksek saflıkta ultrasantrifüj ile izole olduğunu ve monositler üzerinde immün modülasyon sergilediğini göstermiştir.
…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Hackensack UMC Vakfı aracılığıyla cömert finansman desteği için Bay Poddar ve Bay Ludwig için müteşekkiriz. Biz İngilizce düzenleme için Laura Zhao için teşekkür ederiz.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
Riferimenti
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicina. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
