Dynamische Messung und Bildgebung von Kapillaren, Arteriolen und Pericyten im Mausherz
Summary
Präsentiert wird hier ein Protokoll zur Untersuchung der koronaren Mikrozirkulation im lebenden murinen Herzgewebe durch ex vivo-Überwachung des arteriellen Perfusionsdrucks und -flusses, der den Druck aufrechterhält, sowie gefäßvaskulärer Baumbestandteile, einschließlich der Kapillarbetten und Pericyten, da die Septalarterie kanüliert und unter Druck steht.
Abstract
Der koronare arterielle Ton sowie das Öffnen oder Schließen der Kapillaren bestimmen weitgehend den Blutfluss zu Kardiomyozyten bei konstantem Perfusionsdruck. Es ist jedoch schwierig, die dynamischen Veränderungen der koronaren Arteriolen und der Kapillaren im ganzen Herzen zu überwachen, vor allem aufgrund seiner Bewegung und non-stop schlagen. Hier beschreiben wir eine Methode, die die Überwachung der arteriellen Perfusionsrate, des Drucks und der Durchmesseränderungen der Arteriolen und Kapillaren in den rechten ventrikulären Papillarmuskeln der Maus ermöglicht. Die Mausseptalarterie wird kanüliert und bei einem konstanten Durchfluss oder Druck mit der anderen dynamisch gemessenen durchtränz. Nach Perfusion mit einem fluoreszierend gekennzeichneten Lektin (z.B. Alexa Fluor-488 oder -633 mit Weizen-Germ Agglutinin, WGA) konnten die Arteriolen und Kapillaren (und andere Gefäße) in rechten Ventrikelpapillarmuskel und Septum leicht abgebildet werden. Die Gefäßdurchmesseränderungen könnten dann in Gegenwart oder Abwesenheit von Herzkontraktionen gemessen werden. Wenn genetisch kodierte fluoreszierende Proteine exprimiert wurden, konnten bestimmte Merkmale überwacht werden. Zum Beispiel wurden Pericyte in Mausherzen visualisiert, die NG2-DsRed ausdrückten. Diese Methode hat eine nützliche Plattform zur Untersuchung der physiologischen Funktionen von kapillaren Pericyten im Herzen zur Verfügung gestellt. Es eignet sich auch zur Untersuchung der Wirkung von Reagenzien auf den Blutfluss im Herzen durch gleichzeitige Messung des Vaskulären/Kapillardurchmessers und des arteriellen Luminaldrucks. Dieses Präparat, kombiniert mit einem hochmodernen optischen Bildgebungssystem, ermöglicht es, den Blutfluss und seine Kontrolle auf zellulärer und molekularer Ebene im Herzen unter nahezu physiologischen Bedingungen zu untersuchen.
Introduction
Eine angemessene koronare Druck-Durchfluss-Regulierung gewährleistet eine ausreichende Blutversorgung des Herzens, um seine metabolischen Anforderungen zu erfüllen1. Allerdings ist erst vor kurzem deutlich geworden, wie der koronare Druckfluss im Herzen dynamisch reguliert wird, trotz umfangreicher Studien, die in den letzten Jahrzehnten in vivo und in vitro durchgeführt wurden. Einer der Gründe ist die Schwierigkeit, ein physiologisches Arbeitsmodell für solche Studien aufgrund des ständigen Schlagens des Herzens zu etablieren. Unabhängig davon wurden eine Vielzahl von Methoden zur Beobachtung der koronaren Mikrogefäße in lebenden Geweben oder Tieren etabliert, aber keine dieser Methoden war in der Lage, einen konstanten/stabilen Fokus und die Messungen von Druck, Durchfluss und mikrovaskulärem Durchmesser gleichzeitig zu erreichen2,3. Die direkte Visualisierung von koronaren arteriellen Mikrogefäßen im schlagenden Herzen wurde vor Jahrzehnten eingeführt4,3, aber die Durchmessermessungen in kleinen Gefäßen waren anspruchsvoll und die spezifischen Funktionen der vielen spezialisierten Zelltypen, die mit der Mikrozirkulation verbunden sind, waren ebenso ärgerlich. Selbst die Stroboskopmethode und das schwimmende Objektivsystem konnten die oben genannten Informationen nicht gleichzeitig liefern5. Nichtsdestotrotz wurde eine beträchtliche Menge wertvoller Informationen mit den oben genannten Technologien gewonnen, die uns geholfen haben, mehr über die Regulierung des koronaren Blutflusses zu verstehen6. Die Methode, die wir in diesem Papier beschreiben, wird einem helfen, zu untersuchen und im Detail zu verstehen, wie Komponenten der Herzkranzgefäße, der Arteriolen und der Mikrovaskulatur unterschiedlich auf Stimulationen und metabolische Anforderungen reagieren.
Das Arbeitsmodell, das wir für diese Studien etabliert haben, baute auf den früheren Arbeiten von Westerhof et al.2auf. Nach der Kanulation der Septalarterie des Mausherzes wurde eine physiologische Salzlösung verwendet, um diese Arterie zu durchdringen, um die Myozyten und andere Bestandteile des Herzgewebes zu nähren. Der arterielle Perfusionsdruck, der Durchfluss und der Gefäßdurchmesser wurden unter anderem mit hilfe geeigneter Fluoreszenzindikatoren überwacht. Diese Methode ermöglicht es uns, das koronare mikrovaskuläre Bett unter physiologischem Druck im lebenden Gewebe zu visualisieren und zum ersten Mal die zellulären Mechanismen zu untersuchen, die der Mikrozirkulationsregulation zugrunde liegen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der vorliegenden Arbeit haben wir eine bemerkenswert einfache, aber sehr praktische Ex-vivo-Methode eingeführt, um die koronare Mikrozirkulation im Herzen unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Diese Methode wurde aus mechanischen Untersuchungen mit Ratten2modifiziert. Die herausforderungsgemäße Ergänzung war die Bildgebungstechnologie mit hoher Geschwindigkeit und hoher optischer Auflösung. So konnten wir die fortschrittlichen optischen Bildgebungssysteme nutzen, die jetzt im H…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise vom Center for Biomedical Engineering and Technology (BioMET) unterstützt; NIH (1U01HL116321) und (1R01HL142290) und die American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
Materials
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
Riferimenti
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