Medição dinâmica e imagem de capilares, arterioles e pericias em coração de rato
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para estudar a microcirculação coronária no tecido cardíaco murino vivo por ex vivo monitoramento da pressão e fluxo de perfusão arterial que mantém a pressão, bem como componentes de árvores vasculares, incluindo os leitos capilares e pericitos, já que a artéria septal é canulada e pressurizada.
Abstract
O tom arterial coronário, juntamente com a abertura ou fechamento dos capilares, determinam em grande parte o fluxo sanguíneo para cardiomiócitos com pressão constante de perfusão. No entanto, é difícil monitorar as mudanças dinâmicas das artérias coronárias e dos capilares em todo o coração, principalmente devido ao seu movimento e espancamento sem parar. Aqui descrevemos um método que permite o monitoramento da taxa de perfusão arterial, pressão e as alterações de diâmetro das artérias e capilares nos músculos papilares ventriculares do mouse direito. A artéria septal do rato é cânulada e perfundida em um fluxo ou pressão constante com a outra medida dinamicamente. Após a perfusão com uma lectina fluorescente (por exemplo, Alexa Fluor-488 ou -633 rotulada de Agglutinina-Germe de trigo, WGA), as arterioles e capilares (e outros vasos) no músculo papilar e septo papirlículo do ventrículo direito podem ser prontamente imagens. As alterações do diâmetro do vaso poderiam então ser medidas na presença ou ausência de contrações cardíacas. Quando proteínas fluorescentes geneticamente codificadas foram expressas, características específicas poderiam ser monitoradas. Por exemplo, pericítos foram visualizados em corações de camundongos que expressavam NG2-DsRed. Este método forneceu uma plataforma útil para estudar as funções fisiológicas dos pericítos capilares no coração. Também é adequado para estudar o efeito dos reagentes no fluxo sanguíneo no coração, medindo o diâmetro vascular/capilar e a pressão luminal arterial simultaneamente. Esta preparação, combinada com um sistema de imagem óptica de última geração, permite estudar o fluxo sanguíneo e seu controle a nível celular e molecular no coração em condições quase fisiológicas.
Introduction
A regulação adequada do fluxo de pressão coronariana garante o suprimento sanguíneo suficiente ao coração para atender às suas demandas metabólicas1. No entanto, só recentemente ficou claro como o fluxo de pressão coronária é dinamicamente regulado no coração, apesar de extensos estudos que têm sido realizados in vivo e in vitro nas últimas décadas. Uma das razões é a dificuldade em estabelecer um modelo de trabalho fisiológico para tais estudos devido à constante batida do coração. Independentemente disso, uma variedade de métodos foram estabelecidos para a observação dos micro-vasos coronários em tecidos ou animais vivos, mas nenhum desses métodos foi capaz de alcançar foco constante/estável e as medidas da pressão, fluxo e diâmetro microvascular ao mesmo tempo2,3. A visualização direta de micropescos arteriais coronárias no coração pulsante foi introduzida décadas atrás4,3, mas as medidas de diâmetro em pequenos vasos foram desafiadoras e as funções específicas dos muitos tipos de células especializadas associadas à microcirculação foram igualmente vexato. Mesmo o método estromacópico e o sistema objetivo flutuante não puderam fornecer as informações acima simultaneamente5. No entanto, uma quantidade significativa de informações valiosas foi obtida utilizando-se as tecnologias acima mencionadas, que nos ajudaram a entender mais sobre a regulação do fluxo sanguíneo coronário6. O método que estamos descrevendo neste artigo ajudará a investigar e entender detalhadamente como os componentes das artérias coronárias, das artérias e da microvasculatura respondem de forma diferente às estimulações e demandas metabólicas.
O modelo de trabalho que estabelecemos para prosseguir esses estudos foi construído sobre o trabalho anterior de Westerhof et al.2. Após a cannulação da artéria septal do coração do camundongo, a solução fisiológica salina foi usada para perfundir essa artéria para manter os miócitos e outros componentes do tecido cardíaco nutridos. A pressão arterial de perfusão, o fluxo e o diâmetro vascular foram monitorados entre outras funções fisiológicas utilizando indicadores fluorescentes adequados. Este método nos permite visualizar o leito microvascular coronariano sob pressão fisiológica no tecido vivo e estudar os mecanismos celulares subjacentes à regulação da microcirculação pela primeira vez.
Protocol
Representative Results
Discussion
No presente trabalho, introduzimos um método ex vivo notavelmente simples, mas altamente prático, para estudar a microcirculação coronariana no coração em condições fisiológicas. Este método foi modificado a partir de investigações mecânicas utilizando ratos2. A adição desafiadora foi a tecnologia de imagem com alta velocidade e alta resolução óptica. Nós, portanto, fomos capazes de aproveitar os sistemas avançados de imagem óptica que agora estão disponíveis comercialmente….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte pelo Núcleo de Engenharia e Tecnologia Biomédica (BioMET); NIH (1U01HL116321) e (1R01HL142290) e a American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
Materials
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
Riferimenti
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