Dynamisk måling og billeddannelse af kapillærer, arterioler og pericytter i musehjerte
Summary
Præsenteret her er en protokol til at studere koronar mikrocirkulation i levende murin hjertevæv ved ex vivo overvågning af arteriel perfusion tryk og flow, der opretholder trykket, samt vaskulære trækomponenter, herunder kapillær senge og pericytes, som septal arterie er cannulated og tryk.
Abstract
Koronararteriel tone sammen med åbningen eller lukningen af kapillærerne bestemmer stort set blodgennemstrømningen til kardiomyocytter ved konstant perfusionstryk. Det er dog svært at overvåge de dynamiske ændringer i kranspulsårerne og kapillærerne i hele hjertet, primært på grund af dets bevægelse og non-stop slå. Her beskriver vi en metode, der gør det muligt overvågning af arteriel perfusion sats, tryk og diameter ændringer i arterioler og kapillærer i musen højre ventrikulær papillær muskler. Musens septalarterie er cannulated og perfunderes ved et konstant flow eller tryk med den anden dynamisk målt. Efter perfusion med en fluorescerende mærket lectin (f.eks Alexa Fluor-488 eller -633 mærket Hvede-Germ Agglutinin, WGA), arterioler og kapillærer (og andre fartøjer) i højre ventrikel papillær muskel og septum kunne let afbildes. Ændringer i beholderdiameteren kan derefter måles i nærværelse af eller fravær af hjertesammentrækninger. Når genetisk kodede fluorescerende proteiner blev udtrykt, kunne specifikke træk overvåges. For eksempel blev pericytes visualiseret i musehjerter, der udtrykte NG2-DSRed. Denne metode har givet en nyttig platform til at studere de fysiologiske funktioner kapillær pericytes i hjertet. Det er også velegnet til at studere virkningen af reagenser på blodgennemstrømningen i hjertet ved at måle vaskulær / kapillær diameter og arterielt luminalt tryk samtidigt. Dette præparat, kombineret med en state-of-the-art optisk billeddannelse system, giver en mulighed for at studere blodgennemstrømningen og dens kontrol på cellulært og molekylært niveau i hjertet under nær-fysiologiske forhold.
Introduction
Passende regulering af koronartryk sikrer tilstrækkelig blodforsyning til hjertet til at opfylde dets metaboliske krav1. Det er dog først for nylig blevet klart, hvordan koronartryk-flow er dynamisk reguleret i hjertet, på trods af omfattende undersøgelser, der er blevet udført in vivo og in vitro i de sidste årtier. En af grundene er vanskeligheden ved at etablere en fysiologisk arbejdsmodel for sådanne undersøgelser på grund af hjertets konstante slag. Uanset hvad er der etableret en række metoder til observation af koronarmikrokar i levende væv eller dyr, men ingen af disse metoder var i stand til at opnå konstant / stabil fokus og målingerne af tryk, flow og mikrovaskulær diameter på samme tid2,3. Den direkte visualisering af koronararterielle mikrobeholdere i bankende hjerte blev introduceret for årtier siden4,3, men diametermålingerne i små fartøjer var udfordrende, og de specifikke funktioner i de mange specialiserede celletyper, der var forbundet med mikrocirkulationen, var lige så irriterende. Selv den stroboskopiske metode og det flydende objektive system kunne ikke give ovennævnte oplysninger samtidig5. Ikke desto mindre er der opnået en betydelig mængde værdifuld information ved hjælp af ovennævnte teknologier, som har hjulpet os med at forstå mere om reguleringen af koronar blodgennemstrømning6. Den metode, vi beskriver i dette papir, vil hjælpe en med at undersøge og forstå i detaljer, hvordan komponenter i kranspulsårerne, arterierne og mikrovasculaturen reagerer forskelligt på stimuleringer og metaboliske krav.
Den arbejdsmodel, vi etablerede for at forfølge disse undersøgelser, blev bygget på Westerhof et al.2’stidligere arbejde. Efter cannulation af septal arterie af musens hjerte, fysiologisk saltvand løsning blev brugt til at gennemgå, at arterien for at holde myocytter og andre komponenter i hjertevæv næret. Det arterielle perfusionstryk, strømmen og den vaskulære diameter blev overvåget blandt andre fysiologiske funktioner ved hjælp af passende fluorescerende indikatorer. Denne metode gør det muligt for os at visualisere koronar mikrovaskulær seng under fysiologisk tryk i levende væv og studere de cellulære mekanismer, der ligger til grund for mikrocirkulationsregulering for første gang.
Protocol
Representative Results
Discussion
I det nuværende arbejde har vi indført en bemærkelsesværdig enkel, men meget praktisk ex vivo-metode til at studere koronarmikrocirkulationen i hjertet under fysiologiske forhold. Denne metode blev ændret fra mekaniske undersøgelser ved hjælp af rotter2. Den udfordrende tilføjelse var billedbehandlingsteknologien med høj hastighed og høj optisk opløsning. Vi var derfor i stand til at drage fordel af de avancerede optiske billedbehandlingssystemer, der nu er kommercielt tilgængelige. Ve…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af Center for Biomedicinsk Teknik og Teknologi (BioMET); NIH (1U01HL116321) og (1R01HL142290) og American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
Materials
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
Riferimenti
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
- Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
- Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
- Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
- Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
- Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
- Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
- Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
- Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
- Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).
