Collection de biopsies musculaires squelettiques du compartiment supérieur du musculus humain tibialis antérieur pour l’évaluation mécanique

Summary

Ce rapport technique décrit une variation de la technique modifiée de Bergström pour la biopsie du tibialis de musculus antérieur qui limite les dommages de fibre.

Abstract

Les propriétés mécaniques des fibres squelettiques contractantes sont des indicateurs cruciaux de la santé globale des muscles, de la fonction et de la performance. Les biopsies de muscle squelettique humain sont souvent recueillies pour ces efforts. Cependant, relativement peu de descriptions techniques des procédures de biopsie, en dehors du musculus vastus lateralis couramment utilisé, sont disponibles. Bien que les techniques de biopsie soient souvent ajustées pour tenir compte des caractéristiques de chaque muscle à l’étude, peu de rapports techniques partagent ces changements dans la grande communauté. Ainsi, le tissu musculaire des participants humains est souvent gaspillé que l’opérateur réinvente la roue. L’expansion du matériel disponible sur les biopsies à partir d’une variété de muscles peut réduire l’incident des biopsies échouées. Ce rapport technique décrit une variation de la technique bergström modifiée sur le tibialis musculus antérieur qui limite les dommages de fibre et fournit des longueurs de fibre adéquates pour l’évaluation mécanique. La chirurgie est une procédure ambulatoire qui peut être complétée en une heure. La période de récupération de cette procédure est immédiate pour l’activité légère (c.-à-d. la marche), jusqu’à trois jours pour la reprise de l’activité physique normale, et environ une semaine pour les soins des plaies. Le tissu extrait peut être utilisé pour des expériences de force mécanique et nous présentons ici des données d’activation représentatives. Ce protocole est approprié pour la plupart des fins de collecte, potentiellement adaptable à d’autres muscles squelettiques, et peut être amélioré par des modifications à l’aiguille de collecte.

Introduction

L’étude de la physiologie musculaire humaine à des fins cliniques ou de recherche nécessite souvent des biopsies musculaires. Par exemple, un défi majeur dans la physiologie musculaire humaine et la biomécanique est de distinguer et de comprendre les différentes adaptations de la performance musculaire à l’exercice. Les adaptations de performance ne comprennent pas seulement les adaptations structurelles (p. ex., changements dans les protéines contractiles, architecture musculaire), mais comprennent également les adaptations neuronales¹, qui sont très difficiles, voire impossibles, à évaluer séparément lors de l’essai intact des muscles humains in situ. Les expériences de niveau fibre enlèvent ces composants d’ordre supérieur et permettent une évaluation plus directe de la contraction musculaire et peuvent être recueillies par des techniques de biopsie. Des biopsies musculaires ont été recueillies depuis au moins 1868². Aujourd’hui, la technique prédominante pour recueillir les biopsies musculaires est la technique modifiée Bergström^3,4,5, bien que d’autres techniques sont disponibles, y compris l’utilisation d’un conchotome Weil-Blakesley⁶ ou le soi-disant fine-aiguille^7,8. Toutes ces techniques utilisent des instruments spéciaux ressemblant à des aiguilles qui sont conçus pour passer dans les muscles et couper un morceau de tissu. Plus précisément, la technique bergström modifiée utilise une grande aiguille modifiée (taille d’aiguille de 5 mm ici; Figure 1) qui a une fenêtre près de la pointe de l’aiguille et un plus petit trocar interne qui se déplace de haut en bas de l’aiguille, en coupant le muscle lors du passage sur la fenêtre de l’aiguille. Dans ce trocar sacré est un ramrod qui se déplace de haut en bas de l’arbre de la trocar et pousse la biopsie vers la fenêtre de l’aiguille. Pour tirer le muscle dans la fenêtre de l’aiguille, un tuyau d’aspiration est attaché, ce qui aspire l’air de l’aiguille et tire le muscle dans la fenêtre de l’aiguille par pression négative.

Les biopsies musculaires sont souvent acquises pour étudier les changements dans la teneur en protéines, l’expression des gènes ou la morphologie causées par la maladie ou dans une réponse à un programme d’exercice^1,9,10,11. Une autre utilisation critique pour les biopsies musculaires est des expériences mécaniques telles que la mesure de la force contractile de fibre, la rigidité de fibre musculaire, et les propriétés musculaires dépendantes de l’histoire^{12,13,14,15,16}. La mécanique unique de faisceau de fibre ou de fibre sont mesurées en attachant des fibres entre un moteur de longueur et transducteur de force sur des plates-formes spécialisées qui contrôlent la longueur de fibre tout en mesurant simultanément la force. En perméabilisant (p. ex., dépeçage) des fibres, la membrane de sarcolemme devient perméable aux produits chimiques de la solution de bain, permettant un contrôle d’activation en variant la concentration de calcium. En outre, l’effet des propriétés contractiles sur les produits chimiques/ pharmaceutiques/autres protéines peut facilement être évalué en ajoutant le réactif en question à la solution de bain. Cependant, alors que cette technique est très utilisée dans d’autres modèles animaux, sensiblement moins d’études ont effectué des tests mécaniques sur les fibres écorchées de biopsies musculaires humaines^17,18,19. Une raison est que les outils de biopsie et les protocoles sont conçus pour enlever autant de tissu musculaire que possible avec moins de considération pour le niveau de dommages structurels subis lors de l’extraction des tissus. En effet, un protocole de biopsie récente suggère de conduire l’aiguille de biopsie dans le muscle et de recueillir 2-4 morceaux de muscle³. Le processus lui-même ne fait que peu de dommages à l’ADN ou à la matière protéique, mais détruit souvent les structures de fibres et de sarcomériques de telle sorte que l’activation des fibres musculaires devient instable ou impossible. En outre, la longueur relative des fibres dans la biopsie sont généralement courtes (<2 mm) et pas facilement manipulées pour des essais mécaniques. Pour les essais mécaniques, les fibres idéales sont longues (3-5 mm) et non structurellement endommagées.

Des techniques d’extraction de tissus plus avancées peuvent être utilisées pour limiter les dommages causés par les fibres. Par exemple, un groupe²⁰ a profité des « chirurgies ouvertes » préalablement planifiées des avant-bras (p. ex., réparation de fracture osseuse), où les muscles étaient complètement exposés et où un chirurgien était capable de visualiser la structure musculaire et de disséquer soigneusement des échantillons relativement gros et structurellement intacts de tissu musculaire (15 mm x 5 mm x 5 mm). Cette technique de « biopsie ouverte » est favorisée lorsque les participants subissent une procédure précédemment planifiée, et limite ainsi le bassin de participants potentiels, en particulier pour les adultes en bonne santé, où aucune chirurgie n’aurait autrement lieu. Ainsi, beaucoup de biopsies conduites à des fins de recherche sont faites comme une procédure ambulatoire et le site d’incision est maintenu aussi petit que possible pour limiter le risque d’infection, la cicatrisation, et le temps de guérison. Par conséquent, la plupart des biopsies sont recueillies aveuglément (c.-à-d. que l’opérateur est incapable de voir l’aiguille de collecte comme il passe à travers le fascia dans le muscle). Cela implique que la qualité de la biopsie est presque entièrement basée sur la compétence et l’expérience de l’opérateur. Chaque muscle a ses propres difficultés lors de la collecte des tissus, tels que les risques de violer les nerfs et les vaisseaux sanguins, la sélection d’une profondeur de collecte idéale et l’emplacement, et de décider d’une position du corps approprié pour garder le muscle aussi mou que possible. Malheureusement, la plupart des compétences spécifiques aux muscles ne sont pas écrits et donc chaque médecin doit « éinventer la rou » lors de l’exécution de biopsies sur les muscles nouveaux pour eux. Ce manque d’expérience conduit habituellement à plusieurs collections de faible qualité jusqu’à ce que le médecin identifie les meilleures pratiques pour les biopsies sur ce muscle. Les médecins débutants apprennent souvent la compétence par des conversations avec leurs collègues plus expérimentés, mais relativement peu de textes informatifs et évalués par les pairs existent sur la question, en particulier pour les muscles qui ne sont pas traditionnellement utilisés pour la collecte de biopsie. Si nous considérons l’information ci-dessus, ainsi que la difficulté de recruter des volontaires humains pour les biopsies, il est clair que plus d’information pédagogique est nécessaire qui maximise les chances de succès pour chaque participant.

Ainsi, le but de cet article était de présenter une technique de biopsie musculaire qui fournit des protocoles pour la collecte réussie de biopsies musculaires avec de longs fragments de fibres intactes pour des essais mécaniques. Les biopsies de muscle humain sont habituellement effectuées sur, et la majeure partie du matériel de formation de biopsie est sur, le musculus vaste lateralis. Sa taille musculaire relativement grande et son emplacement superficiel par rapport à la peau permettent la collecte de tissus musculaires adéquats, tout en minimisant l’inconfort du patient et les traumatismes physiques^1,21. Cependant, il y a certaines limites à l’utilisation du vastus lateralis pour les études de formation longitudinales. Par exemple, au cours de protocoles expérimentaux qui comprennent un programme de formation, les participants doivent s’abstenir de toute formation supplémentaire en dehors de l’étude pendant une période qui s’étend souvent sur 2 à 6 mois. Pour les athlètes, ce n’est souvent pas possible, car le vastes lateralis est habituellement formé lors d’exercices typiques (p. ex., squats, sauts), ou est généralement utilisé pour le sport (p. ex., course à pied, cyclisme). Ces expériences d’entraînement distinctes loin de l’objectif de l’étude peuvent provoquer des adaptations musculaires qui modifient la mécanique musculaire, l’architecture et la physiologie de telle sorte qu’il est difficile ou impossible de connaître l’effet réel du protocole expérimental de l’étude sur les propriétés musculaires. Pour ce genre d’études, il serait idéal de choisir un muscle cible qui n’est souvent pas au centre des régiments d’entraînement. Le tibialis musculus antérieur (TA) est un muscle cible idéal qui satisfait les exigences ci-dessus. En outre, les interventions de formation peuvent être ciblées vers le TA en utilisant des approches contrôlables, comme avec l’utilisation d’un dynamomètre. Il n’y a presque aucun matériel d’entraînement se rapportant à une biopsie musculaire de TA. Par conséquent, nous avons développé un protocole modifié pour recueillir des biopsies musculaires relativement intactes de l’AT.

Protocol

REMARQUE : Ci-dessous, nous décrivons un protocole pour récolter les fibres mécaniquement intactes du TA des volontaires qui ont été inscrits à une étude en cours distincte. Ce protocole est similaire à celui décrit par Shanely et coll.3, qui ont décrit la technique bergström modifiée dans le vaste lateralis. L’information présentée ici a été affinée par notre groupe de recherche, mais peut ne pas être idéale pour tous les groupes de laboratoire ou les configurations organisat…

Representative Results

L’engagement de temps entier pour un participant était environ une heure (consultation de 10 min, échographie de 10 min, préparation de chirurgie de 20 min et administration anesthésique, chirurgie de 10 min, et 10 min de récupération). Souvent, les participants ont inconsciemment activé leur TA et ont eu besoin de rappels cohérents pour garder le muscle aussi détendu que possible. Lorsque l’aiguille de biopsie était à l’intérieur du muscle, les participants ont habituellement rapporté une sensation un…

Discussion

Dans ce rapport, nous avons décrit une technique pour la biopsie du tissu musculaire structurellement intact de TA. Nous avons constaté que cette procédure donne une teneur acceptable en fibres musculaires utilisables (5-10 préparations de faisceau de fibres par 50 mg de tissu collecté) pour les tests mécaniques. De plus, nous avons eu assez de tissu pour des expériences mécaniques, génétiques et protéomiques de suivi.

Il existe plusieurs méthodes généralement utilisées pour la …

Materials

26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe	B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany	4606027V	Drug administration
5mm Berstöm needle	homemade	N/A	Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	269700	elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics, Mannheim, Germany	11836145001	Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept	PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany	9805630	Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	7238201	Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip	Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain	66002876	wound closure
Surgical disposable scalpels	Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany	BA200 series	Incision
Unihaft cohesive elastic bandage	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	4589600	cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin	Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany	N/A	Controlled substance anesthesia, vasoconstriction