機械評価のためのヒト筋学の上室から骨格筋生検の収集

Summary

この技術報告書は、繊維損傷を制限する筋液脛節前部の生検のための修正されたベルクストローム技術のバリエーションを説明している。

Abstract

骨格繊維の収縮の機械的特性は、全体的な筋肉の健康、機能、および性能の重要な指標です。ヒト骨格筋生検は、これらの努力のためにしばしば収集される。しかし、生検手順の技術的な記述は比較的少なく、一般的に使用される筋肉性の外側の外側の外側の、利用可能である。生検技術は、多くの場合、研究中の各筋肉の特性に対応するように調整されますが, いくつかの技術的なレポートは、より大きなコミュニティにこれらの変化を共有しています.したがって、オペレータが車輪を再発明するにつれて、ヒト参加者からの筋肉組織はしばしば無駄になる。様々な筋肉から生検に利用可能な材料を拡大すると、失敗した生検の事件を減らすことができます。この技術レポートでは、繊維損傷を制限し、機械的評価に十分な繊維長を提供する筋学脛節前部に対する修正されたBergström技術のバリエーションについて説明します。手術は1時間で完了できる外来処置です。この処置の回復期間は、光活動(すなわち、歩行)、正常身体活動再開のために最大3日間、創傷ケアのために約1週間即時である。抽出された組織は機械的な力の実験に使用することができ、ここで我々は代表的な活性化データを提示する。このプロトコルは、ほとんどの収集目的に適しており、他の骨格筋に適応可能であり、収集針の変更によって改善される可能性がある。

Introduction

臨床や研究目的のための人間の筋肉生理学の研究は、多くの場合、筋肉の生検を必要とします.例えば、ヒトの筋肉生理学とバイオメカニクスにおける大きな課題は、運動する筋肉の性能の様々な適応を区別し、理解することです。パフォーマンスの適応には、構造的適応(例えば、収縮タンパク質の変化、筋肉アーキテクチャ)だけでなく、神経適応¹も含まれており、それは不可能ではないにしても、その人の筋肉でそのままテストするときに別々に評価するのが非常に難しい。繊維レベルの実験は、これらの高次成分を除去し、筋肉収縮のより直接的な評価を可能にし、生検技術を介して収集することができる。筋肉生検は、少なくとも1868²以来収集されている。今日、筋肉生検を収集する主な技術は、修正されたベルクストローム技術^{33、4、5ですが、4,5}ワイル・ブレイクスリー・コンコトーム⁶またはいわゆるファインニードル^77、88の使用を含む他の技術が利用可能である。これらの技術はすべて、筋肉に渡し、組織の一部を切断するように設計された特別な針のような楽器を使用しています。具体的には、変更されたベルクストローム技術は、大きな変更された針(ここでは5ミリメートルの針のサイズ)を使用しています。図 1)針先に近い窓と針の上下に移動する小さな内部トロカールがあり、針の窓の上を通過するときに筋肉を切断します。このハロートロカールの中には、トロカールのシャフトを上下に移動し、生検を針の窓に向かって押すラムロッドがあります。針の窓に筋肉を引っ張るために、吸引ホースが取り付けられ、針から空気を吸い出し、負圧で筋肉を針の窓に引き込みます。

筋肉生検は、多くの場合、疾患によって引き起こされるタンパク質含有量、遺伝子発現、または形態の変化を研究するために、または運動プログラム^{11、9、10、119,10,11}に応答して取得される。筋肉生検のもう一つの重要な用途は、繊維収縮力の測定、筋線維の剛性、および歴史依存性の筋肉特性^{12、13、14、15、1613,14,15,16}などの機械的実験である。¹²単繊維または繊維束の力学は、長さのモーターと力のトランスデューサの間に繊維を取り付けることによって、同時に力を測定しながら繊維長を制御する特殊なリグに測定される。繊維を透過(例えば、スキニング)することにより、サルコレンマ膜は、浴液中の化学物質に透過性となり、カルシウム濃度を変化させることによって活性化制御を可能にする。さらに、化学物質/医薬品/他のタンパク質に対する収縮特性の効果は、問題の試薬を浴液に添加することで容易に評価することができます。しかし、この技術は他の動物モデルで非常に使用されているが、著しく少ない研究は、ヒト筋肉生検^{17、18、1918}から皮膚繊維の機械的試験^を19行った。¹⁷その理由の1つは、生検ツールとプロトコルが、組織抽出中に持続する構造的損傷のレベルをあまり考慮していない限り多くの筋肉組織を除去するように設計されているからです。確かに、最近の生検プロトコルは、生検針を筋肉に駆動し、筋肉³の2〜4個の塊を収集することを示唆している。このプロセス自体はDNAやタンパク質材料にほとんどダメージを与えませんが、筋線維の活性化が不安定になったり不可能になるような方法で繊維や肉体の構造を破壊することがよくあります。さらに、バイオプシー内の繊維の相対的な長さは、通常、短い(<2 mm)、機械的なテストのために容易に処理されません。機械的試験のために、理想的な繊維は長く(3-5 mm)、構造的に損傷を受けていない。

より高度な組織抽出技術は、繊維損傷を制限するために使用することができる。例えば、あるグループ²⁰ は、以前に計画されていた前腕の「開いた手術」(例えば、骨折修復)を利用して、筋肉が完全に露出し、外科医が筋肉構造を可視化し、筋肉組織の比較的大きく構造的に損傷のないサンプル(15mm x 5mm x 5mm)を慎重に解剖することができた。この「オープンバイオプシー」技術は、参加者が以前に計画された手順を受けているときに好まれるので、特に手術が行われない健康な成人のために、潜在的な参加者のプールを制限します。したがって、研究目的で行われる多くの生検は外来処置として行われ、切開部位は感染リスク、瘢痕化、治癒時間を制限するために可能な限り小さく保たれる。したがって、ほとんどの生検は 盲目的に 収集されます(すなわち、オペレータは筋膜を通って筋肉に入る収集針を見ることができません)。これは、生検の質がオペレータのスキルと経験にほぼ完全に基づいていることを意味します。すべての筋肉は、神経や血管を侵すリスク、理想的な採取深度と位置の選択、筋肉を可能な限り緩く保つための適切な身体位置の決定など、組織を収集する際に独自の困難を抱えています。残念ながら、筋肉特有のスキルセットのほとんどは書き留められていないので、各医師は新しい筋肉の生検を行う際に「車輪を再発明する」必要があります。経験のこの欠如は、医師がその筋肉の生検のためのベストプラクティスを識別するまで、通常、低品質でいくつかのコレクションにつながります.初心者の医師は、多くの場合、彼らの経験豊富な同僚との会話を通じてスキルを学びますが、特に生検コレクションに伝統的に使用されていない筋肉のために、この問題に関しては比較的有益で査読されたテキストが存在します。上記の情報を考慮すると、生検のための人間のボランティアを募集することの難しさと共に、すべての参加者の成功の可能性を最大化するより多くの教育情報が必要であることは明らかです。

したがって、本論文の目的は、機械的検査のために長く損傷を受けていない線維片を有する筋肉生検の収集を成功させるためのプロトコルを提供する筋肉生検技術を提示することであった。ヒトの筋肉生検は通常行われ、生検の訓練材料の大部分が上にあり、筋肉スの広大な側面が上にある。皮膚に対する比較的大きな筋肉サイズと表面的な位置は、患者の不快感と身体的外傷^を最小化しながら、十分な筋肉組織の収集を可能^にする^1、21。しかし、縦方向のトレーニング研究のために広大な横方向の分析を使用することにはいくつかの制限があります。例えば、トレーニングプログラムを含む実験的なプロトコルの間、参加者はしばしば2〜6ヶ月に及ぶ期間、研究外の追加のトレーニングを控えなければなりません。アスリートにとって、広大なラテラリスは通常、典型的な運動(例えば、スクワット、ジャンプ)中に訓練されるか、または一般的にスポーツ(例えば、ランニング、サイクリング)のために使用されるので、これはしばしば不可能である。研究の目的から離れたこれらの別々のトレーニング経験は、筋肉の特性に対する研究の実験プロトコルの真の影響を知ることは困難または不可能であるような方法で筋肉の力学、アーキテクチャ、および生理学を変える筋肉の適応を引き起こす可能性があります。これらのタイプの研究では、多くの場合、訓練連隊の焦点ではないターゲット筋肉を選択するのが理想的であろう。筋力脛筋(TA)は、上記の要件を満たす理想的なターゲット筋肉です。さらに、ダイナモメーターを使用するなど、制御可能なアプローチを使用してTAに向けてトレーニング介入を行うことができます。TA筋肉生検に関するトレーニング資料はほとんどありません。そこで、TAから比較的損傷のない筋肉生検を収集する改質プロトコルを開発しました。

Protocol

注:以下では、別の進行中の研究に登録されたボランティアのTAから機械的に損傷のない繊維を収穫するためのプロトコルを概説します。このプロトコルは、シャネリーら3によって記述されたものと似ていますが、その中で、変性されたベルクストローム法を広大なラテラリスで説明しています。ここに示す情報は、研究グループによって洗練されていますが、すべてのラボ…

Representative Results

参加者の全時間のコミットメントは約1時間(10分の相談、10分超音波、20分手術準備と麻酔投与、10分手術、10分の回復)でした。多くの場合、参加者は無意識のうちにTAを活性化し、筋肉を可能な限りリラックスさせるために一貫したリマインダーを必要としました。生検針が筋肉の中にあったとき、参加者は通常、中等度から激しい不快感の時折期間で、生検針の周りの領域でユニークな「圧?…

Discussion

本報告では、TAから構造的に損傷を受けていない筋組織の生検の手法について述べた。この手順は、機械的検査のために使用可能な筋線維(収集された組織の50mgあたり5〜10繊維束調製物)の許容可能な含有量を生み出すことがわかった。さらに、我々は、フォローアップ機械的、遺伝的、およびプロテオーム実験のための十分な組織を持っていました。

筋肉生検^,<su…

Materials

26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe	B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany	4606027V	Drug administration
5mm Berstöm needle	homemade	N/A	Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	269700	elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics, Mannheim, Germany	11836145001	Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept	PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany	9805630	Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	7238201	Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip	Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain	66002876	wound closure
Surgical disposable scalpels	Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany	BA200 series	Incision
Unihaft cohesive elastic bandage	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	4589600	cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin	Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany	N/A	Controlled substance anesthesia, vasoconstriction