アグロバクテリウム-媒介遺伝子変換、トランスジェニック産生、および米における男性生殖発達の研究への応用
Summary
この研究は、CRISPR-Cas9ゲノム編集技術を使用して内因性遺伝子 OsABCG15 をノックアウトし、続いて修飾 されたアグロバクテリウム媒介変換プロトコルを使用して、米中に安定な男性滅菌ラインを生成することを説明する。
Abstract
男性の無菌性は、通常、男性の生殖器官/配偶体の機能的欠陥によって特徴付けられるハイブリッド種子生産のための重要な農学形質である。CRISPR-Cas9ゲノム編集技術の最近の進歩により、特定の部位における内因性候補遺伝子の高い編集効果とタイムセービングノックアウト突然変異が可能になります。さらに、米のアグロバクテリウム媒介性遺伝子改変は、多くの公的および民間の研究所で広く採用されている遺伝子改変のための重要な方法でもあります。本研究では、CRISPR-Cas9ゲノム編集ツールを用いて、JaPONICa品種におけるOsABCG15の標的ゲノム編集により、3つの男性無菌変異株の生成に成功した。我々は、米中のハイブリッド種子生産のための遺伝的発育の優れた手段を提供することができる改変されたアグロバクテリウム媒介米変換法を使用した。トランスジェニック植物は2~3ヶ月以内に得ることができ、ホモ接合形質転換体はPCR増幅とサンガーシーケンシングを用いた遺伝子型入力によりスクリーニングされた。男性の無菌ホモ接合系の基本的な表現型特徴付けは、米雄生殖器官の顕微鏡観察によって行われ、ヨウ素カリウム(I2-KI)を開発するアンサーの半薄い断面2染色による花粉生存率解析を行った。
Introduction
米は、特に発展途上国で最も重要な食糧作物であり、世界人口の半分以上の主食です。全体として、米穀物の需要は増加しており、2030年には50%、2050年には100%増加1,すると予測されている。今後の米産出量の改善は、米を単一植物研究の優れたモデルにする多様な分子および遺伝的資源を活用する必要があります。これらには、効率的な変換システム、高度な分子地図、および長年にわたって生成された表現されたシーケンスタグの一般にアクセス可能なデータベースが含まれます。作物の収量を改善するための1つの戦略は、ハイブリッド種子生産5、その中心的な要素は、男性の生殖能力を操作する能力です。穀物作物における男性の生殖能力の分子制御を理解することは、ハイブリッド種子生産を改善し、作物の生産性を高めるために実用的な技術に重要な知識を翻訳するのに役立ちます6,,7.
遺伝子変換は、作物植物における外来遺伝子の導入や内因性遺伝子の操作を可能にし、遺伝子組み換えラインの生成を可能にするため、基礎研究および商業農業のための重要なツールです。適切な変換プロトコルは、遺伝子調節の基本的な理解のための遺伝的および分子生物学研究を加速するのに役立ちます 8.細菌では、遺伝的変換は自然に起こります。しかし、植物では、分子生物学の技術99,1010を用いて人工的に行われる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスは、T-DNA(T-DNA)を植物性プラスミドの領域であるT-DNAをIV型分泌系11,12,12を介して植物細胞に移すことによって植物のクラウン胆汁病を引き起こす土壌媒介のグラム陰性細菌である。植物において、A.トゥメファシアン-媒介性変換は、T-DNAのホストゲノム13への安定かつ低コピー数の統合をもたらすため、遺伝子改変のための広範な方法と考えられている。トランスジェニック米は、1990年代半ばにジャポニカ品種14でアグロバクテリウム媒介遺伝子変換を経て初めて生成された。このプロトコルを使用して、トランスジェニックラインを4ヶ月以内に得られ、変換効率は10%~30%であった。この研究は、成熟した種子からの胚起源のカルスの誘導であり、もう1つは植物14、15,15の変換効率を高くすることを可能にする共培養中の細菌培養にフェノール性化合物であるアセトシリンゴンの添加である。このプロトコル,は、japonica,,16、17、18、19だけでなく、17,18インディカ191620、21、22、23および熱帯ジャポニカ22212324、25,25などの他の品種でマイナーな変更で広く使用されています。20,実際、米の変容を説明する記事の80%以上は、ツール13としてアグロバクテリウム媒介遺伝子変換を使用する。現在までに、カルス誘導16、17、18、19,17,18の出発物質として、米の種を用いていくつかの遺伝的変換プロトコルが19開発されてきた。しかし、カルス生産の外植者としての若い花序についてはほとんど知られていない。全体的に、機能性ゲノミクスの迅速で再現性のある効率的な遺伝子変換と再生プロトコルの確立と作物の改善に関する研究が重要です。
近年、CRISPR-Cas9技術の進歩により、遺伝子機能を理解し、植物飼育26,27,27に対する農業学的に重要な改善を提供する精密なゲノム編集機構が生まれています。CRISPRはまた、男性の生殖の発達とハイブリッド生産の操作のためのかなりの約束を提供しています。本研究では、CRISPR-Cas9技術を用いた遺伝子ノックアウトシステムを活用し、若い花序を外植体として効率的な米遺伝子変換プロトコルに結合し、生殖発達の研究に安定した男性の滅菌ラインを作製した。
Protocol
Representative Results
Discussion
人工原発性男性の生殖不能変異体は、伝統的にランダムな物理的、化学的、または生物学的突然変異によって生成される。これらは強力な技術ですが、そのランダムな性質は、分子育種32のカスタマイズされた改善を提供する可能性を秘めた膨大な量の現代のゲノム知識を活用することができません。CRISPR-Cas9システムは、DNA29、33を操作し、<sup clas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、若い米の花序と米組織培養培地の製造支援を提供したXiaofei Chenを認めたい。この研究は中国国立自然科学財団(31900611)によって支援されました。
Materials
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
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