Agrobacterium-매개 유전 변환, 트랜스 제닉 생산, 그리고 쌀에서 남성 생식 개발의 연구에 대 한 그것의 응용 프로그램
Summary
이 작품은 CRISPR-Cas9 게놈 편집 기술을 사용하여 내인성 유전자 OsABCG15를 녹아웃한 다음 수정된 Agrobacterium-매개변환 프로토콜을 사용하여 쌀에서 안정적인 남성 멸균 라인을 생성합니다.
Abstract
남성 멸균은 일반적으로 남성 생식 기관/게임테의 기능적 결함을 특징으로 하는 하이브리드 종자 생산을 위한 중요한 농업 특성입니다. CRISPR-Cas9 게놈 편집 기술의 최근 발전은 특정 사이트에서 내인성 후보 유전자의 높은 편집 효능 및 시간 절약 녹아웃 돌연변이를 허용합니다. 또한, 쌀의 아그로박테리움-중재된유전적 변화는 또한 많은 공공 및 민간 실험실에서 널리 채택된 유전자 변형을 위한 중요한 방법입니다. 이 연구에서는 CRISPR-Cas9 게놈 편집 도구를 적용하고 japonica 품종에서 OsABCG15의 표적 게놈 편집을 통해 3개의 남성 멸균 돌연변이 라인을 성공적으로 생성했습니다. 우리는 쌀에서 하이브리드 종자 생산을위한 유전 방출의 우수한 수단을 제공 할 수있는 수정 된 Agrobacterium-매개 쌀 변환 방법을 사용했다. 형질전환 식물은 2-3개월 이내에 얻을 수 있으며, 동종변성 변압제는 PCR 증폭 및 Sanger 시퀀싱을 사용하여 유전자를 사용하여 스크리닝하여 스크리닝하였다. 남성 멸균 균성 라인의 기본 피노티픽 특성화는 쌀 남성 생식 기관의 현미경 관찰에 의해 수행되었으며, 요오드 칼륨 요오드 (I2-KI)에 의한 꽃가루 생존 가능성 분석에 의해 개발 중인 멸균의 반 박형 단면화를 염색하였다.
Introduction
쌀은 특히 개발도상국에서 가장 중요한 식품 작물이며, 전 세계 인구의 절반 이상을 위한 주식 식품입니다. 전체적으로 쌀알에 대한 수요가 증가하고 있으며 2030년까지 50%, 2050년1,2에100% 증가할 것으로 예상됩니다.1 쌀 수율의 향후 개선은 쌀을 단장 식물 연구를위한 훌륭한 모델로 만드는 다양한 분자 및 유전 자원을 활용해야합니다. 여기에는 효율적인 변환 시스템, 고급 분자 맵 및 표현된 시퀀스 태그의 공개적으로 액세스할 수 있는 데이터베이스가 포함되며, 이는 수년 동안 생성된3,,4. 작물 수확량을 개선하기 위한 한 가지 전략은 하이브리드 종자 생산5이며,그 중 핵심 요소는 남성 다산을 조작하는 기능입니다. 시리얼 작물에서 남성 다산의 분자 제어를 이해 하이브리드 종자 생산을 개선 하 고 작물 생산성 향상 을 위해 실용적인 기술로 주요 지식을 번역 하는 데 도움이 될 수 있습니다6,,7.
유전자 변환은 작물 식물에 있는 외국 유전자의 소개 또는 내인성 유전자의 조작을 가능하게 하고, 유전자 변형 선의 생성귀착되기 때문에 기본적인 연구 및 상업적 농업을 위한 중요한 공구입니다. 적절한 변형 프로토콜은 유전자 조절8의근본적인 이해를 위한 유전 및 분자 생물학 연구를 가속화하는 데 도움이 될 수 있다. 박테리아에서, 유전 변환은 자연적으로 일어난다; 그러나, 식물에서는 분자 생물학 기법9,,10을사용하여 인위적으로 수행된다. Agrobacterium tumefaciens는 T-DNA를 전송하여 식물에 크라운 담즙 질환을 일으키는 토양 매개, 그램 음성 박테리아, T-DNA의 영역, 유형 IV 분비 시스템을 통해 식물 세포로11,,12. 식물에서, A. tumefaciens-매개변환은 숙주 게놈(13)으로 T-DNA의 안정적이고 낮은 복사13수 통합으로 유도되기 때문에 유전자 변형을 위한 광범위한 방법으로 간주됩니다. 트랜스제닉 쌀은 1990년대 중반 자포니카 품종14에서 아그로박테리움-중재유전자변환을 통해 처음 생성되었다. 이 프로토콜을 사용하여 변환 효율이 10%-30%인 4개월 이내에 여러 트랜스제닉 라인을 획득했습니다. 연구 결과는 성공적인 변환을 위한 2개의 중요한 단계가 있다는 것을 표시했습니다: 하나는 성숙한 씨앗에서 배아 원소의 유도이고 다른 하나는 식물14,,15에서더 높은 변환 효율성을 허용하는 공동 재배 도중 세균 문화에 아세토시링곤, 페놀 화합물의 추가입니다. 이 프로토콜은 japonica16,17,,,18,,19뿐만 아니라 인디카,20,21,22, 23및 열대 japonica23 ,24,,25와같은 다른 품종에서 사소한 변경으로 광범위하게 사용되었습니다., 실제로, 쌀 변환을 설명하는 기사의 80% 이상이 Agrobacterium-매개유전자 변환을 도구로사용한다(13). 현재까지, 여러 유전자 변형 프로토콜은,쌀 씨를 서두유도16,17,,18,19의시작 재료로 사용하여 개발되었다., 그러나, 거의 콜러스 생산을위한 흥분으로 젊은 꽃에 대해 알려져있다. 전반적으로 기능성 유전체학 및 작물 개선에 대한 연구를 위한 신속하고 재현 가능하며 효율적인 유전자 변환 및 재생 프로토콜을 확립하는 것이 중요합니다.
최근 몇 년 동안 CRISPR-Cas9 기술의 발전은 유전자 기능을 이해하고 식물 사육26,,27에대한 농업적으로 중요한 개선을 제공하는 정밀한 게놈 편집 메커니즘을 초래했다. CRISPR은 또한 남성 생식 개발 및 하이브리드 생산의 조작에 대한 상당한 약속을 제공합니다. 이 연구에서는 CRISPR-Cas9 기술을 이용한 유전자 녹아웃 시스템을 활용하여 젊은 꽃식물을 사용하여 효율적인 쌀 유전자 변형 프로토콜에 결합하여 생식 발달 연구를 위한 안정적인 남성 멸균 선을 생성했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인공 유전자 남성 멸균 돌연변이는 전통적으로 무작위 물리적, 화학적, 또는 생물학적 돌연변이발생에 의해 생성됩니다. 이들은 강력한 기술이지만, 그들의 무작위 자연은 분자사육32에있는 맞춤형 개선을 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있는 현대 유전체 지식의 광대 한 양을 활용하지 못합니다. CRISPR-Cas9 시스템은 DNA29,,33을조작하?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 샤오페이 첸이 쌀 조직 배양 배지를 만드는 데 있어 젊은 쌀 꽃가루와 도움을 제공한 것에 대해 인정하고 자합니다. 이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (31900611)에 의해 지원되었다.
Materials
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
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