Summary
Presentiamo un metodo semplice per isolare le cellule progenitrici adipose altamente vitali dalle pastiglie di grasso epididimale del topo utilizzando lo smistamento delle cellule attivato a fluorescenza.
Abstract
L'obesità e i disturbi metabolici come diabete, malattie cardiache e cancro sono tutti associati a un drammatico rimodellamento dei tessuti adiposi. Le cellule progenitrici adipose residenti nei tessuti (APC) svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi dei tessuti adiposi e possono contribuire alla patologia tissutale. L'uso crescente di tecnologie di analisi a singola cellula , tra cui il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e la proteomica a singola cellula, sta trasformando il campo delle cellule staminali / progenitrici consentendo una risoluzione senza precedenti dei cambiamenti di espressione delle singole cellule nel contesto dei cambiamenti a livello di popolazione o tessuto. In questo articolo, forniamo protocolli dettagliati per sezionare il tessuto adiposo epididimale del topo, isolare le singole cellule derivate dai tessuti adiposi ed eseguire lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS) per arricchire per uno Sca1+/ CD31-/CD45-/Ter119- APC praticabile. Questi protocolli consentiranno agli investigatori di preparare APC di alta qualità adatti per analisi a valle come il sequenziamento dell'RNA a cella singola.
Introduction
Il tessuto adiposo gioca un ruolo chiave nel metabolismo energetico. L'energia in eccesso viene immagazzinata sotto forma di lipidi e il tessuto adiposo è in grado di espansione o retrazione significativa a seconda dello stato nutrizionale e della domanda energetica. L'espansione del tessuto adiposo può derivare da un aumento delle dimensioni degli adipocite (ipertrofia) e/o da un aumento del numero di adipocite (iperplasia); quest'ultimo processo strettamente regolato dalla proliferazione e differenziazione delle cellule progenitrici adipose1,2. Durante l'obesità, il tessuto adiposo si espande eccessivamente e la disfunzione tissutale - tra cui ipossia, infiammazione e resistenza all'insulina -si sviluppa spesso 3,4. Queste complicanze sono fattori di rischio per molte malattie croniche tra cui ipertensione, diabete, malattie cardiovascolari, ictus e cancro5. Pertanto, limitare l'espansione incontrollata dei tessuti adiposi e mitigare le patologie tissutali adipose sono le principali priorità di ricerca biomedica. Durante l'espansione del tessuto adiposo, le cellule staminali derivate dai tessuti adiposi residenti (ASC) proliferano e si differenziano in sequenza in preadipociti (cellule progenitrici impegnate) e quindi in adipociti maturi6. Recenti studi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) mostrano che queste popolazioni di cellule progenitrici adipose (APC) (ASC e preadipociti) mostrano una sostanziale eterogeneità molecolare e funzionale7,8,9,10,11,12. Ad esempio, gli ASC mostrano una ridotta capacità di differenziazione adipogenica, ma presentano anche maggiori capacità di proliferazione ed espansione, rispetto ai preadipociti7. Ulteriori differenze molecolari sono riportate all'interno delle popolazioni ASC e preadipocite, anche se la rilevanza funzionale di queste differenze rimane poco chiara7. Insieme, questi dati evidenziano la complessità del pool di cellule progenitrici adipose e sottolineano la necessità di sviluppare e standardizzare strumenti per comprendere e manipolare meglio queste popolazioni di cellule critiche.
Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento delle popolazioni di cellule progenitrici ad alta vitalità Sca1+ adipose dalle pastiglie di grasso epididimomale del topo adatte per analisi sensibili a valle, tra cui studi a cella singola (sequenziamento scRNA) e coltura cellulare. L'isolamento e la dissociazione dei cuscinetti di grasso epididimali è statoeseguito come descritto in precedenza 7,13 con lievi modifiche che migliorano la vitalità delle APC isolate. In breve, le cellule dissociate dai cuscinetti adiposi epididimali sono macchiate di anticorpi contro Sca1, un marcatore sia per gli ASC che per i preadipociti6,7e altri marcatori di lignaggio (Lin): Ter119 (cellule erythroid), CD31 (cellule endoteliali) e CD45 (leucociti). Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- le celle vengono quindi ordinate in base all'ordinamento cellulare attivato a fluorescenza (FACS). È importante sottolineare che questo protocollo è stato convalidato da un riuscito isolamento e analisi di cellule progenitrici sca1+/lin- adipose praticabili riportate in un recente studio di sequenziamento dell'RNA a singola cellula che ha identificato sottopopolazioni funzionalmente eterogenee all'interno di ASC e preadipociti7.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state eseguite sotto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Mayo Clinic.
1. Preparazione della soluzione
- Preparare la soluzione di collagenasi al 2% (w/v) sciogliendo la collagenasi II 2 g nella soluzione salina bilanciata di Hanks da 100 mL (HBSS). Aliquota 200 μL ciascuno per ogni utilizzo.
- Preparare il mezzo di neutralizzazione mescolando 84 mL F-12 medium, 15 mL di siero di cavallo e 1 mL penicillina/streptomicina.
- Preparare il tampone di citometria a flusso sciogliendo 500 mg di albumina di siero bovino (BSA) e 400 μL di 0,5 M EDTA in 100 mL della salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco.
2. Dissezione del cuscinetto adiposo epididimale e della dissociazione tissutale
- Eutanasia umana (isoflurane/lussazione cervicale) di un topo maschio. In questo protocollo è stato utilizzato un mouse FVB di quattro mesi.
- Applicare/spruzzare il 70% di etanolo sull'addome ed esporre la cavità addominale inferiore utilizzando forbici e forcep pulite.
- Individuare il cuscinetto grasso epididimico (prossimale/attaccato ai teste). Tenere la giunzione tra teste e cuscinetto grasso epididimale con forcette smussate e tirare delicatamente per liberare il cuscinetto grasso epididimale.
- Rimuovere i teste tagliando con forbici e incubare il cuscinetto di grasso epididimale in 5 ml di HBSS integrato con 3% di BSA in un tubo conico da 50 ml a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Centrifuga a 150 x g per 7 min a 4 °C.
- Prendere il cuscinetto di grasso epididimale galleggiante dal tubo conico da 50 ml e tritare finemente il tessuto usando forbici pulite.
- Aggiungere 200 μL di collagenasi soluzione al 2% in 3,8 ml di HBSS in un tubo di coltura da 13 ml. Aggiungere il tessuto tritato e incubare in un'incubatrice rotante a 5 giri/min per 1 h a 37 °C. Invece di un incubatore rotante, l'incubatore di coltura cellulare a 37 °C può essere usato alternativamente con agitazioni occasionali.
- Trasferire l'intero contenuto in un tubo conico da 50 ml e aggiungere 10 ml di mezzo di neutralizzazione. Mescolare delicatamente invertendo il tubo 2-3 volte.
- Preparare un altro tubo conico da 50 ml dotato di un filtro a celle da 70 μm. Filtrare il tessuto digerito nel nuovo tubo utilizzando il filtro cellulare.
- Trasferire il flusso fino a un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 350 x g per 10 min a 4 °C.
- Rimuovere con cura i pellet di cellule supernatanti e resuspend con 5 mL di DPBS. Centrifuga a 350 x g per 10 min a 4 °C.
- Rimuovere con cura il supernatante e aggiungere 50 μL di tampone di citometria di flusso. Mescolare bene tubazione delicatamente e mantenere le cellule sul ghiaccio. A causa del volume del pellet cellulare e della piccola quantità di supernatante residuo, il volume totale di cellule nel buffer di citometria del flusso sarà maggiore di 50 μL (circa 100 μL).
3. Etichettatura degli anticorpi e smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS)
- Dopo aver mescolato bene le cellule con una tubazione delicata, trasferire 54 μL della sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 1,7 ml. Aggiungere 6 μL di reagente bloccante FcR e mescolare bene tubazione delicatamente. Incubare a 4 °C per 10 min. Salvare le cellule rimanenti dopo aver preso 54 μL e tenerle nel ghiaccio da utilizzare come controllo non macchiato nel passaggio 3.5 e nel passaggio 3.6.
- Durante l'incubazione nella fase 3.1, preparare un cocktail di anticorpi combinando 11 μL ciascuno di anticorpi anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC e anti-CD45-FITC in un tubo di microcentrifugo. Mescolare bene con una pipettazione delicata e mantenere il ghiaccio protetto dalla luce.
- Dopo l'incubazione con reagente bloccante FcR per 10 min, aggiungere 40 μL del cocktail anticorpale e mescolare bene con pipettaggio delicato. Incubare a 4 °C per 10 min.
- Aggiungere 500 μL di tampone di citometria di flusso integrato con 1 μg/mL di DAPI nelle celle macchiate. Mescolare bene con tubazioni delicate e celle filtranti utilizzando una provetta da 5 ml con tappo a scatto del filtro a celle. Tieni le cellule sul ghiaccio.
- Aggiungere 500 μL di tampone di citometria di flusso alle cellule rimanenti nel passaggio 3.1 e mescolare bene con una pipettazione delicata. Filtrare le celle utilizzando una provetta da 5 ml con tappo a scatto del filtro cellulare. Tenere queste cellule sul ghiaccio e utilizzarle come controllo non macchiato nel passaggio seguente.
- Porta le celle macchiate e il controllo non macchiato allo strumento di analisi o ordinamento FACS.
- Identificare e isolare la popolazione APC+/FITC-/DAPI- con strategie di gating mostrate nella figura 1. Queste celle rappresentano cellule Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45. I detriti e gli aggregati cellulari sono esauriti utilizzando grafici a dispersione in avanti (FSC) e a dispersione laterale (SSC). Quindi, DAPI- la popolazione è gated, seguita da gating di APC+/ FITC- popolazione. I controlli non macchiati devono essere utilizzati per aiutare a impostare i parametri di gating.
- Raccogliere le cellule in 500 μL di tampone di citometria di flusso in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. Andando avanti, tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili per ridurre al minimo una contaminazione. Circa 50.000 - 100.000 cellule vengono raccolte da un topo.
- Contare le cellule usando un emocitometro per valutare la vitalità cellulare. Poiché gli aggregati cellulari possono interferire con ulteriori analisi a valle, viene valutata anche la presenza di aggregati cellulari per garantire una presenza minima (<5% del numero di cellule vitali) di questi aggregati.
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Representative Results
In questo esperimento sono stati utilizzati topi FVB maschi di quattro mesi. Dopo l'esclusione di detriti e doppietti utilizzando appezzamenti FSC/SSC, le cellule vitali (DAPI- popolazione) sono state gated, seguite dalla selezione di APC+/FITC- popolazione (Figura 1). I gate DAPI, APC e FITC sono stati disegnati in base al controllo non macchiato. Le strategie di gating sono mostrate nella figura 1.
Dopo 1 h di cernita, la qualità dell'isolamento è stata valutata quantitativamente mediante analisi della citometria del flusso(figure 2,3). Le celle sono state macchiate con soluzione di ioduro propidio (1:100) per la colorazione di vitalità. Utilizzando la stessa gating per lo smistamento, le celle hanno mantenuto un'elevata vitalità e purezza: 92,6 ± 2,2% singole celle (terzo pannello nella figura 2),86,4 ± vitalità del 3,0% (PI- celle) e 86,0 ± 2,8% APC+/FITC- celle (n= 4, media ± deviazione standard). Queste percentuali sono state definite come percentuali di ogni popolazione gated (singole celle, PI- celle e PI-/APC+/FITC- popolazione, rispettivamente, nella figura 2) rispetto al numero totale di celle.
Figura 1: Isolamento di cellule singole progenitore sca1+ adiposo vitali da parte del FACS. Le strategie di gating sono mostrate sia nelle celle macchiate che in un controllo non macchiato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi rappresentativa della citometria del flusso per valutare la vitalità delle cellule post-isolamento. La colorazione di vitalità è stata eseguita utilizzando ioduro di propidio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione della percentuale di cellule 1 h post-isolamento nell'analisi della citometria del flusso. Percentuali di singole celle, celle vitali e celle APC+/FITC- sono state quantificate per valutare la purezza e la vitalità dopo l'isolamento delle cellule. I dati visualizzati rappresentano la ± deviazione standard. n=4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) sta rapidamente guadagnando trazione come un potente strumento per studiare contemporaneamente diverse popolazioni cellulari a livello di singola cellula. A causa degli elevati costi associati alla preparazione del campione e all'elevato sequenziamento della produttività, è imperativo ottimizzare gli input cellulari (alta vitalità e purezza) per aumentare la probabilità di successo sperimentale. Alcuni protocolli di preparazione cellulare si basano sulla rimozione di cellule morte e detriti utilizzando lavaggi a basso spin e separazione a colonna senza smistamento FACS14. Molti di questi metodi, tuttavia, riducono significativamente il numero di cellule recuperate vitali e, in molti casi, le cellule morte non vengono completamenterimosse 14. Questo protocollo delinea un metodo semplice per isolare cellule progenitrici Sca1+ adipose altamente vitali contenenti detriti cellulari minimi, doppietti cellulari e cellule morte. Sebbene le celle isolate utilizzando questo protocollo mostravano un'elevata vitalità, si consiglia comunque di ridurre al minimo il tempo tra l'isolamento delle celle e un'ulteriore analisi a valle per mantenere un'elevata vitalità. Inoltre, l'etichettatura degli anticorpi di successo è fondamentale per isolare le cellule progenitrici Sca1+ adipose con elevata purezza. Pertanto, la determinazione della concentrazione ottimale di anticorpi è fortemente raccomandata per ogni anticorpo e la diluizione degli anticorpi nella fase 3.2 può essere regolata di conseguenza.
Questo protocollo basato sulla citometria a flusso è suscettibile di personalizzazione a seconda dell'interesse individuale per specifiche sotto-popolazioni di cellule progenitrici adipose. Qui, combinazioni di anticorpi alternative possono essere utilizzate per identificare e isolare la popolazione o le popolazioni di interesse. In effetti, a causa dell'ampia diversità dei marcatori APC, più laboratori che studiano le APC utilizzando scRNA-seq segnalano l'isolamento delle cellule utilizzando altri marcatori di superficie. Ad esempio, LE celle PDGFRA+/CD44+ , CD31-/CD45-/Ter119-/CD29+/CD34+/Sca1+ e Le celle Pdgfrb+ sono state isolate da FACS per le analisi scRNA-seq APC downstream8,9,11. Anche lesottopopolazioni CD142 + sono state caratterizzate e hanno dimostrato di mostrare una limitata capacità di differenziazione adipogenica e la capacità di sopprimere l'adipogenesi10,11. Oltre a Sca1, combinazioni di anticorpi contro CD55, CD81 e CD9 sono state recentemente utilizzate per isolare prospetticamente le sottopopolazioni asc e preadipocite (utilizzando questo protocollo) e studiare l'eterogeneità molecolare e funzionale della sottopopolazione7. Inoltre, poiché le cellule progenitrici adipose di altri cuscinetti adiposi tra cui cuscinetti adiposi inguinali e tessuti adiposi marroni sono state isolate utilizzando la dissociazione della collagenasi come l'attuale protocollo15,16,17, il presente protocollo può essere applicabile all'isolamento delle cellule progenitrici adipose da altri tessuti adiposi.
Un avvertimento dell'approccio attuale è che è adattato all'isolamento delle APC immature. Sebbene il presente protocollo produca APC ad alta vitalità, l'efficacia e l'efficienza dell'isolamento di altri tipi di cellule residenti nei tessuti adiposi (ad esempio cellule immunitarie, fibroblasti, cellule endoteliali, ecc.) non è chiara. È importante sottolineare che questo protocollo non è adatto per l'isolamento di adipociti maturi. Gli adipociti sono stati estremamente difficili da isolare usando facs a causa delle loro grandi dimensioni cellulari e fragilità. Recentemente, l'isolamento degli adipociti maturi da parte della FACS è stato segnalato utilizzando una grande dimensione dell'ugello (150 μm) e una bassa pressione di sheath (6 psi) con una specifica strategia di sgating FSC / SSC18. Studi futuri potrebbero forse fondere questo protocollo di isolamento adipocite con il protocollo qui descritto per stabilire una pipeline più completa per isolare e studiare diversi tipi di cellule all'interno del tessuto adiposo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo la Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility per l'assistenza allo smistamento FACS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C.
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
