Summary
우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.
Abstract
당뇨병, 심장병 및 암과 같은 비만 및 대사 장애는 모두 극적인 지방 조직 리모델링과 관련이 있습니다. 조직 거주자 지방 선조 세포 (APC)는 조직 항상성에 중요한 역할을하고 조직 병리학에 기여할 수 있습니다. 단세포 RNA-염기서열 분석 및 단세포 프로테오믹스를 포함한 단일 세포 분석 기술의 사용이 증가하고 있으며, 인구 또는 조직 전반의 변화의 맥락 내에서 개별 세포 발현 변화의 전례 없는 해결을 허용함으로써 줄기/전구 세포 분야를 변화시키고 있다. 이 문서에서는 마우스 부피 지방 조직을 해부하고, 단일 지방 조직 유래 세포를 분리하고, 형광 활성화 세포 정렬(FACS)을 수행하여 실행 가능한 Sca1 +/CD31-/CD45-/Ter119- APC에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜을 통해 조사관은 단일 세포 RNA 염기서열분석과 같은 다운스트림 분석에 적합한 고품질 APC를 준비할 수 있습니다.
Introduction
지방 조직은 에너지 대사에 중요한 역할을합니다. 과도한 에너지는 지질의 형태로 저장되며, 지방 조직은 영양 상태와 에너지 수요에 따라 상당한 확장 또는 후퇴가 가능합니다. 지방 조직의 확장은 지방 세포 크기 (비대) 및 /또는 지방 세포 수 (hyperhyperasia)의 증가에서 발생할 수 있습니다. 후자의 과정은 지방 선조 세포의 증식 및 분화에 의해 단단히조절된다 1,2. 비만 도중, 지방 조직은 과도하게 확장되고, 조직 기능 장애 – 저산소증을 포함하여, 염증 및 인슐린 저항 - 수시로3,4를개발합니다. 이러한 합병증은 고혈압, 당뇨병, 심혈관 질환, 뇌졸중 및 암5를포함한 많은 만성 질환에 대한 위험 요소입니다. 따라서 통제되지 않는 지방 조직 확장을 제한하고 지방 조직 병리학을 완화하는 것이 최고의 생체 의학 연구 우선 순위입니다. 지방 조직 팽창 동안, 상주 지방 조직 유래 줄기 세포 (ASC)는 증식하고 preadipocytes로 순차적으로 분화 (헌신적 인 전구 세포) 다음 성숙한 지방 세포6로분화한다. 최근 단세포 RNA-시퀀싱(scRNA-seq) 연구는 이러한 지방 선조 세포(APC) 집단(ASC 및 preadipocytes)이 상당한 분자 및 기능성 이질성7,8,9,10,11,12를나타낸다는것을 보여준다. 예를 들어, ASC는 감소된 사이포겐화 분화 능력을 표시하는 동시에, 또한 지방세포7에비해 더 높은 증식 및 확장 기능을 나타낸다. 추가 분자 다름은 ASC 및 preadipocyte 인구 내에서 보고됩니다, 그러나 이 다름의 기능적인 관련성은 불분명남아7. 함께, 이러한 데이터는 지방 선조 세포 풀의 복잡성을 강조하고 더 나은 이해하고 이러한 중요한 세포 인구를 조작하기 위해 도구를 개발하고 표준화 할 필요성을 강조한다.
이 프로토콜은 단일 세포 연구 (scRNA-시퀀싱) 및 세포 배양을 포함하여 민감한 다운스트림 분석에 적합한 마우스 상피 지방 패드에서 높은 생존성 Sca1+ 지방 전구 집단의 분리를 자세히 설명합니다. 상고체 지방 패드의 격리 및 해리는 이전에 설명된 바와 같이 수행되었다7,13 격리 된 APC의 생존가능성을 개선하는 약간의 수정. 간단히 말해서, 상고성 지방 패드에서 해리된 세포는 Sca1에 대한 항체, ASC 및 프리디포사이클6,7및기타 계보(Lin) 마커모두에 대한 마커로 염색됩니다: Ter119(적혈구), CD31(내피 세포), CD45(leukocytes). 실행 가능한 Sca1+/ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- 세포는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 의해 정렬됩니다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 ASC 및 프레디포세포7내의 기능적으로 이질적인 하위 집단을 확인한 최근 단세포 RNA 시퀀싱 연구에서 보고된 실행 가능한 Sca1 +/Lin-분면 전구 세포의 성공적인 격리 및 분석에 의해 검증되었다.
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Protocol
모든 동물 실험 절차는 메이요 클리닉 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 솔루션 준비
- 콜라게나아제 2% (w/v) 용액을 100mL 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로 콜라게나아제 II 2g을 용해시켜 준비합니다. Aliquot 200 μL 각 사용에 대 한.
- 84mL F-12 배지, 15mL 말 혈청, 1mL 페니실린/연쇄절제술을 혼합하여 중화 매체를 준비한다.
- 덜베코의 인산완충식식염(DPBS)의 100mL에서 소 세럼 알부민(BSA)과 0.5M EDTA의 400 μL을 용해하여 유동 세포측정 버퍼를 준비한다.
2. 부피성 지방 패드 및 조직 해리의 해부
- 인간적으로 안락사 (이소플루란 / 자궁 경부 탈구) 하나의 남성 마우스. 이 프로토콜에서는 4개월 된 FVB 마우스가 사용되었습니다.
- 복부에 70% 에탄올을 바르고 깨끗한 가위와 집게를 사용하여 하복부를 노출시합니다.
- 부피성 지방 패드(상반된 지방 패드/고환에 부착)를 찾습니다. 무딘 집게와 고환과 고환 지방 패드 사이의 접합을 잡고 부피 지방 패드를 해방부드럽게 당깁니다.
- 실온에서 50mL 원피스 튜브에서 3%의 BSA로 보충된 HBSS5mL에서 가위를 사용하여 절단하여 고환을 제거하고 5mL 의 부피성 지방 패드를 15분 동안 제거합니다.
- 원심분리기는 4°C에서 7분 동안 150 x g의 원심분리기.
- 50mL 원뿔관에서 부동 부피 지방 패드를 가지고 깨끗한 가위를 사용하여 조직을 잘게 다진다.
- 13mL 배양 튜브에 200 μL 콜라게나아제 2% 용액을 3.8mL의 HBSS에 추가합니다. 다진 조직을 추가하고 37 °C에서 1 시간 동안 5 rpm에서 회전 인큐베이터에 인큐베이션을 넣습니다. 회전 인큐베이터 대신 37°C의 세포 배양 인큐베이터는 가끔 동요와 함께 사용할 수 있습니다.
- 전체 내용을 50mL 원문 튜브로 옮기고 10mL의 중화 매체를 추가합니다. 튜브를 2-3번 반전시켜 부드럽게 섞는다.
- 70 μm 세포 스트레이너가 장착된 또 다른 50mL 원전 튜브를 준비합니다. 소화된 조직을 세포 여과기를 사용하여 새로운 튜브로 필터링합니다.
- 4°C에서 10분 동안 350 x g에서 15mL 원심분리기및 원심분리기로 유동을 전달합니다.
- 조심스럽게 상체를 제거하고 DPBS의 5 mL로 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 4°C에서 10분 동안 350 x g의 원심분리기.
- 상체를 조심스럽게 제거하고 50 μL의 유동 세포 측정 버퍼를 추가합니다. 부드럽게 파이펫으로 잘 섞어서 얼음 위에 세포를 보관하세요. 세포 펠릿의 부피와 소량의 잔류 상류체로 인해, 유동 세포 분석 버퍼내의 총 세포 부피는 50 μL(약 100 μL)을 초과할 것이다.
3. 항체 라벨링 및 형광 활성화 셀 정렬(FACS)
- 세포를 부드러운 파이펫팅과 잘 혼합한 후 셀 서스펜션의 54 μL을 1.7mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮기습니다. FcR 블로킹 시약 6μL을 추가하고 부드럽게 파이펫팅하여 잘 섞습니다. 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. 54 μL을 복용한 후 남은 세포를 저장하고 얼음에 보관하여 3.5 단계 및 3.6 단계에서 스테인드 컨트롤로 사용하십시오.
- 3.1 단계에서 의 배양 중에, 마이크로센티립후지 튜브에 각각 11 μL의 안티-Sca1-APC, 안티-테르119-FITC, 안티 CD31-FITC 및 안티 CD45-FITC 항체를 결합하여 항체 칵테일을 준비한다. 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞어서 빛으로부터 보호되는 얼음을 유지하세요.
- FcR 블로킹 시약으로 10분 동안 배양한 후 항체 칵테일의 40 μL을 추가하고 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 염색된 셀에 DAPI 1 μg/mL로 보충된 500 μL의 유동 세포분석 버퍼를 추가합니다. 셀 스트레이너 스냅 캡이 있는 5mL 테스트 튜브를 사용하여 부드러운 파이펫팅및 필터 셀로 잘 섞으세요. 얼음에 세포를 유지합니다.
- 3.1 단계에서 남은 셀에 500 μL의 유동 세포 측정 버퍼를 추가하고 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 셀 스트레이너 스냅 캡이 있는 5mL 테스트 튜브를 사용하여 셀을 필터링합니다. 이 세포를 얼음위에 유지하고 다음 단계에서 스테인드 컨트롤로 사용하십시오.
- 스테인드 셀과 스테인드 컨트롤을 FACS 분석 또는 정렬 기기로 가져 가라.
- 도 1에표시된 게이팅 전략으로 APC+FITC-/DAPI- 인구를 식별하고 격리합니다. 이 세포는 실행 가능한 Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- 세포를 나타냅니다. 파편 및 셀 응집체는 전방(FSC) 및 측면 분산(SSC) 플롯을 사용하여 고갈됩니다. 그런 다음, DAPI- 인구가 문이 닫힌 다음 APC+/ FITC- 인구의 게이팅이 뒤따릅니다. 스테인드 컨트롤은 게이팅 매개 변수를 설정하는 데 사용되어야 합니다.
- 1.5mL 마이크로센트심리후지 튜브에서 500μL의 유동 세포분석 완충제로 세포를 수집한다. 앞으로 모든 절차는 오염을 최소화하기 위해 멸균 조건에서 수행되어야합니다. 대략 50,000 - 100,000 세포는 1개의 마우스에서 집합됩니다.
- 세포 생존가능성을 평가하기 위해 혈종계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포 집계는 추가 다운스트림 분석을 방해할 수 있기 때문에 셀 집계의 존재도 평가되어 이러한 응재의 최소 존재(실행 가능한 셀 수의 5%)를 보장합니다.
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Representative Results
4개월 된 남성 FVB 마우스는 이 실험에서 사용되었다. FSC/SSC 플롯을 사용하여 파편과 이중을 제외한 후 실행 가능한 세포(DAPI-인구)가 게이트되었고, 그 다음으로 APC+/FITC-인구(도1)의선택이 뒤따랐다. DAPI, APC 및 FITC 게이트는 스테인드 컨트롤을 기반으로 그려졌습니다. 게이팅 전략은 그림 1에표시됩니다.
1h 분류 후, 절연의 질은 유동 세포측정분석(그림 2,3)에의해 정량적으로 평가되었다. 세포는 생존성 염색을 위해 프로피듐 요오드 용액(1:100)으로 염색하였다. 분류에 동일한 게이팅을 사용하여, 세포는 높은 생존력과 순도를 유지했다: 92.6 ± 2.2% 단일 세포 (도 2의세 번째 패널), 86.4 ± 3.0% 생존율 (PI- 세포), 86.0 ± 2.8% APC+/FITC- 세포 (n = 4, 평균 ± 표준 편차). 이러한 백분율은 총 세포 수에 비해 각 게이트 집단(단일 세포,PI- 세포 및 PI-/APC+FITC- 인구, 각각 도 2)의백분율로 정의되었다.
그림 1: FACS에 의한 실행 가능한 Sca1+ 선조 단일 세포의 격리. 게이팅 전략은 스테인드 셀과 스테인드 컨트롤 모두에서 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 대표적인 유동 세포 분석으로 격리 후 세포 생존가능성을 평가합니다. 생존성 스테인링은 프로피듐 요오드를 사용하여 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유동 세포측정 분석에서 세포 1h 후 격리의 백분율의 정량화. 단일 세포, 실행 가능한 세포 및 APC+FITC의 백분율- 세포는 세포의 격리 후 순도와 생존가능성을 평가하기 위해 정량화되었다. 표시된 데이터는 표준 편차를 ± 평균을 나타냅니다. n=4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 단일 세포 수준에서 다양한 세포 집단을 동시에 연구하는 강력한 도구로서 빠르게 견인력을 얻고 있다. 시료 준비와 높은 처리량 시퀀싱과 관련된 높은 비용으로 인해 실험 성공 가능성을 높이기 위해 세포 입력(높은 생존가능성 및 순도)을 최적화하는 것이 필수적입니다. 일부 세포 준비 프로토콜은 FACS 정렬14없이 낮은 스핀 세차및 컬럼 기반 분리를 사용하여 죽은 세포 및 파편제거에 의존한다. 그러나 이러한 방법의 대부분은 실행 가능한 복구 된 세포의 수를 크게 감소시키고 많은 경우에 죽은 세포가 완전히 제거되지 않습니다14. 이 프로토콜은 최소한의 세포 이물질, 세포 이중 및 죽은 세포를 포함하는 매우 실행 가능한 Sca1+ 지방 전구 세포를 격리하는 간단한 방법을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 격리된 세포는 높은 생존력을 보였지만, 높은 생존력을 유지하기 위해 세포 격리와 추가 다운스트림 분석 사이의 시간을 최소화하는 것이 좋습니다. 또한, 성공적인 항체 라벨링은 Sca1+ 지방 선조 세포를 높은 순도로 분리하는 데 중요합니다. 따라서, 항체의 최적 농도의 결정은 각 항체에 대해 강력히 권장되며, 3.2 단계에서 항체의 희석을 적절히 조정할 수 있다.
이러한 흐름 세포측정 기반 프로토콜은 특정 지방 선조 세포 하위 집단에 대한 개인의 관심에 따라 사용자 정의할 수 있습니다. 여기서, 대체 항체 조합은 관심있는 인구를 식별하고 격리하는 데 사용될 수 있다. 실제로 광범위한 APC 마커 다양성으로 인해 다른 표면 마커를 사용하여 세포를 격리하는 scRNA-seq 보고서를 사용하여 APC를 연구하는 다중 실험실. 예를 들어, PDGFRA +/CD44+ 세포, CD31 - /CD45-/Ter119-/CD29+/CD34+/Sca1+ 세포, 및 Pdgfrb+ 세포는 다운스트림 APC scRNA-seq 분석8,9,11에대한 FACS에 의해 격리되었다. CD142+ 하위집단도 특징지어지고 있으며, 제한된 사이포겐성 분화 능력과 사이포발생(10,11)을억제하는 능력을 나타내는 것으로 나타났다. Sca1 이외에, CD55, CD81 및 CD9에 대하여 항체의 조합은 최근에 ASC 및 지방세포 하위 집단(이 프로토콜을 사용하여)을 장래 분리하고 하위 집단 분자 및 기능성 이질성7을연구하기 위하여 이용되었다. 더욱이, 인기구 지방 패드 및 갈색 지방 조직을 포함한 다른 지방 패드로부터의 전구 세포를 포화화하기 때문에 현재의정서(15,16,17)와같은 콜라겐나아제 해리를 사용하여 분리되어 있으며, 본 프로토콜은 다른 지방 조직으로부터 지방 전조 세포의 격리에 적용될 수 있다.
현재 접근 방식의 한 가지 주의 사항은 미숙한 APC의 격리에 맞게 조정된다는 것입니다. 본 프로토콜은 높은 생존성 APC를 산출하지만, 다른 지방 조직 상주 세포 유형(즉, 면역 세포, 섬유아세포, 내피 세포 등)의 격리의 효능 및 효율은 불분명하다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 성숙한 지방세포의 격리에 적합하지 않다. Adipocytes 는 큰 세포 크기와 취약성 때문에 FACS를 사용하여 분리하기가 매우 어려웠습니다. 최근에는 FACS에 의한 성숙한 안도세포의 분리는 특정 FSC/SSC 게이팅전략(18)을가진 큰 노즐 크기(150 μm) 및 저칼집 압력(6 psi)을 사용하여 보고되었다. 미래 연구는 아마도 지방 조직 내에서 다양한 세포 유형을 분리하고 연구하기 위해 보다 포괄적 인 파이프 라인을 확립하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜과이 지방 분리 격리 프로토콜을 병합 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 FACS 분류에 대한 지원을 위해 메이요 클리닉 현미경 세포 분석 코어 흐름 세포 분석 시설을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
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