Bereiding van virusverrijkt entmateriaal voor orale infectie van honingbijen (Apis mellifera)
Summary
Hier beschrijven we twee protocollen: ten eerste om grote hoeveelheden niet-omhulde virusdeeltjes van honingbijen te vermeerderen, te extraheren, te zuiveren en te kwantificeren, inclusief een methode voor het verwijderen van honingbijpoppen en ten tweede om de effecten van virale infectie te testen met behulp van een zeer herhaalbare kooibioassay met hoge doorvoer.
Abstract
Honingbijen zijn van groot ecologisch en agrarisch belang over de hele wereld, maar zijn ook onderhevig aan een verscheidenheid aan druk die de gezondheid van bijen negatief beïnvloedt, waaronder blootstelling aan virale pathogenen. Dergelijke virussen kunnen een breed scala aan verwoestende effecten veroorzaken en kunnen vaak een uitdaging zijn om te bestuderen vanwege meerdere factoren die het moeilijk maken om de effecten van experimentele behandelingen te scheiden van reeds bestaande achtergrondinfectie. Hier presenteren we een methode om grote hoeveelheden virusdeeltjes massaal te produceren, samen met een bioassay met hoge doorvoer om virale infecties en effecten te testen. Noodzakelijk door het huidige gebrek aan een continue, virusvrije cellijn van honingbijen, worden virale deeltjes in vivo versterkt met behulp van honingbijpoppen, die in grote hoeveelheden uit de korf worden geëxtraheerd met behulp van minimaal stressvolle methodologie. Deze virusdeeltjes kunnen vervolgens worden gebruikt in bioassays van honingbijenkooien om de levensvatbaarheid van inentcula te testen, evenals verschillende andere virusinfectiedynamiek, waaronder interacties met voeding, pesticiden en andere pathogenen. Een groot voordeel van het gebruik van dergelijke deeltjes is dat het de kans op het introduceren van onbekende variabelen in latere experimenten aanzienlijk vermindert in vergelijking met de huidige alternatieven, zoals infectie via geïnfecteerde bijenhemolymfe of homogenaat, hoewel er nog steeds voorzichtig moet worden omgegaan bij het vinden van de bijen, om achtergrondvirusbesmetting te minimaliseren. De kooitests zijn geen vervanging voor grootschalige, veldrealistische experimenten die virusinfectie-effecten op kolonieniveau testen, maar functioneren in plaats daarvan als een methode om baseline virale reacties vast te stellen die, in combinatie met de semi-zuivere virusdeeltjes, kunnen dienen als belangrijke hulpmiddelen om verschillende dimensies van fysiologische interacties tussen honingbijen en virussen te onderzoeken.
Introduction
Honingbijen (Apis mellifera) spelen een cruciale rol in het moderne wereldwijde landbouwlandschap, maar lijden momenteel aan een combinatie van biotische en abiotische stressoren, waaronder blootstelling aan pesticiden, slecht ruwvoer, parasieten en pathogenen 1,2. Een van de belangrijkste pathogenen van zorg zijn virussen, waarvan er vele worden overgedragen door een andere van de belangrijkste honingbijstressoren, de parasitaire Varroamijt (Varroa destructor). Deze virussen kunnen een reeks negatieve effecten bij honingbijen veroorzaken, waaronder verminderde broedoverleving, ontwikkelingsstoornissen en verlamming die kunnen leiden tot totale ineenstorting van de korf, zowel voor als na overwinteringsperioden 3,4,5. Hoewel er veelbelovende vooruitgang is geboekt bij de ontwikkeling van technologieën die worden gebruikt om virusinfecties te bestrijden 6,7,8,9, is de dynamiek waarmee veel virussen zich verspreiden, verspreiden en interageren binnen een honingbij of kolonie nog steeds slecht begrepen 5,10 . Het begrijpen van de basisbiologie van honingbij- en virusinteracties en hun relaties met andere omgevingsfactoren is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van effectieve virusbeheertechnieken.
Het bestuderen van interacties tussen honingbijen en virussen vormt echter uitdagingen met tal van bekende en onbekende factoren die het proces bemoeilijken. Deze omvatten interacties met dieet11,12, blootstelling aan pesticiden13 en genetische achtergrond bijen14,15. Zelfs wanneer ze zich alleen richten op virusinfectie, komen complicaties vaak voor omdat honingbijenpopulaties, zowel beheerd als wild, altijd een zekere mate van achtergrondvirusinfectie hebben, hoewel vaak zonder acute symptomen te manifesteren16,17, en de effecten van virus-co-infectie zijn niet goed begrepen18. Dit heeft de studie van honingbijviruseffecten moeilijk te ontwarren gemaakt.
Veel honingbijvirusstudies hebben circumstantial virusinfecties gebruikt om te zoeken naar interacties met andere stressoren, waarbij wordt waargenomen hoe achtergrondinfecties veranderen met andere behandelingen 12,19,20,21. Hoewel deze aanpak succesvol is geweest bij het identificeren van belangrijke effecten, met name het ontdekken hoe pesticiden of dieetbehandelingen de virusniveaus en replicatie beïnvloeden, is inenting met een virusbehandeling met bekende inhoud en concentratie van cruciaal belang voor het experimenteel testen van de dynamiek van virusinfecties. Toch kan het scheiden van experimentele behandeling van achtergrondinfectie ook uitdagingen opleveren. In veldstudies hebben onderzoekers stammen van het misvormde vleugelvirus (DWV) gedifferentieerd om bewijs te leveren voor virusoverdracht van honingbijen naar hommels22, maar het gebruik van deze aanpak zou moeilijk zijn bij honingbijen alleen. Virus infectieuze klonen zijn een krachtig hulpmiddel, niet alleen voor het volgen van infectie 23,24,25 maar ook voor omgekeerde genetische studies van honingbijvirussen en voor virus-gastheer interactie onderzoek 26,27,28. In de meeste gevallen zijn infectieuze klonen echter nog steeds nodig om de infectiecyclus in cellen te vervullen om deeltjes te produceren. Dergelijke deeltjes hebben de voorkeur als inocula voor experimentele behandelingen omdat hun infectiviteit hoger is dan het naakte virale RNA en inenting met ingekapselde genomen een natuurlijke infectie nabootst.
De productie van zuivere, niet-verontreinigde inencula uit het honingbijenvirus (virusstammen van het wilde type of stammen die zijn afgeleid van infectieuze klonen) vormt ook een uitdaging. Deze zijn voornamelijk te wijten aan de moeilijkheden bij het verkrijgen van een betrouwbare, continu replicerende, virusvrije honingbijencellijn om zuivere stamvirussen te produceren29,30. Hoewel sommige cellijnen zijn geproduceerd, blijven deze systemen onvolmaakt; toch is er hoop dat er een levensvatbare cellijn kan worden geproduceerd29, die een fijnere controle van de virusproductie en -onderzoek mogelijk zou maken. Totdat een dergelijke lijn op grote schaal beschikbaar komt, zullen de meeste virusproductieprotocollen blijven vertrouwen op het gebruik van in vivo virusproductie en -zuivering 18,31,32,33,34. Deze benaderingen omvatten het identificeren en zuiveren van virusdeeltjes van belang (of het produceren van een infectieuze kloon) en het gebruik ervan om honingbijen te infecteren, meestal als poppen. De poppen worden geïnjecteerd met het doelvirus en vervolgens opgeofferd, en verdere deeltjes worden geëxtraheerd en gezuiverd. Omdat echter geen bijen om te beginnen virusvrij zijn, is er altijd een zekere mate van besmetting van sporen van andere virussen in een dergelijk concentraat, en daarom moet grote zorg worden besteed aan het kiezen van bijen met een lage kans op achtergrondinfecties. Verder zijn methoden voor het verwijderen van de poppen uit de kamcellen voor gebruik in deze protocollen33 zeer arbeidsintensief en kunnen ze stress bij de bijen veroorzaken, waardoor de productie op deze manier wordt beperkt18,32. Hier rapporteren we een alternatieve methode die grootschalige verwijdering van larven mogelijk maakt met weinig arbeid en minder mechanische stress op de bijen.
Zodra poppen zijn verkregen en geïnjecteerd met het beginnende virus entmateriaal, moeten ze worden geïncubeerd om het virus de tijd te geven zich te vermenigvuldigen. Vervolgens kunnen geproduceerde virusdeeltjes worden verwerkt tot een vorm die bruikbaar is om experimentele bijen te infecteren. Er zijn verschillende eenvoudige methoden om dit te bereiken, waaronder het gebruik van een ruw homogenaat35,36 of hemolymfe gegenereerd door viraal geïnfecteerde bijen als een bron van infectie37. Deze methoden zijn effectief, maar lopen op een grotere kans om onbekende variabelen uit het achtergrondsubstraat te introduceren (bijvoorbeeld andere factoren in de dode bijenhomogenaten). Bovendien is het wenselijk om de deeltjes te concentreren als een experiment vereist dat in korte tijd een grote, bekende dosis van een virus wordt gegeven. Daarom heeft het voor een betere controle de voorkeur om methoden te gebruiken die een zekere mate van zuivering en concentratie van de virusdeeltjes mogelijk maken. Over het algemeen zal een reeks neerslag- en centrifugeringsstappen resulteren in de verwijdering van bijna al het mogelijke niet-doelvirusmateriaal33.
Na de productie van dit geconcentreerde entmateriaal is het gunstig om de virale titers (qPCR) te kwantificeren en te karakteriseren met in vivo bioassays om de levensvatbaarheid en het vermogen om sterfte te veroorzaken te testen, en om te bevestigen dat verhoogde virustiters worden verkregen na infectie. Dit kan worden bereikt door injectie-experimenten (in poppen of volwassenen) of voedingsexperimenten (in larven of volwassenen). Hoewel al deze benaderingen mogelijk zijn, is het voeren aan groepen volwassen bijen in een kooi vaak de snelste en eenvoudigste. De kooitestmethode wordt ook veel gebruikt voor het testen van verschillende andere behandelingen op bijen, waaronder pesticidentoxiciteit38, ovariumontwikkeling39 en voedingsinvloed op gedrag40,41 en kan daarom een goede basis vormen voor experimenten die virusinfectie koppelen aan andere factoren42.
Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het produceren van grote hoeveelheden semi-zuivere, hoogverrijkte virusdeeltjes zonder een dure ultracentrifuge te gebruiken, inclusief een methode voor het verwijderen van poppen die arbeid en mechanische stress op de bijen vermindert en een zeer herhaalbare, high-throughput bioassay voor het testen van virale infectie en effecten. Door de zuiverheid van het virale entapparaat strak te controleren, kunnen onderzoekers de variatie in de virale respons van honingbijen verminderen ten opzichte van andere virale inentingsmethoden. Bovendien kan de bioassay screenen op virale effecten op een niveau van kleine groepen met behulp van zeer herhaalbare experimentele eenheden voordat wordt geschaald naar veldrealistische instellingen, wat veel arbeidsintensiever is om te beheren. In combinatie bieden deze twee methoden de nodige hulpmiddelen voor studies die kunnen helpen ons algehele begrip van fysiologische interacties tussen honingbijen en virussen te verbeteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we methoden beschreven die elke stap van het virusversterkings- en entmateriaalbereidingsproces beschrijven, inclusief het verzamelen van larven en virusvermeerdering, extractie en concentratie, evenals virale behandeling in de vorm van kooivoedingsexperimenten. Deze methoden maken de productie van semi-zuivere virusdeeltjes mogelijk (figuur 4), waarvan de effectiviteit consequent kan worden gekwantificeerd door dosis-respons mortaliteitstests voor virussen die dodelijk zijn voor…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Julia Fine bedanken voor haar ideeën en discussie tijdens het proces van het maken van het protocol, evenals Dr. Cassondra Vernier voor haar nuttige opmerkingen tijdens het bewerken. Deze materialen droegen bij aan projecten die mede werden ondersteund door de Foundation for Food and Agriculture Research, onder subsidie ID 549025.
Materials
| 10% bleach solution | |||
| 24:1 chloroform:isoamyl alcohol | SigmaAldrich | C0549 | |
| 70% ethanol solution | |||
| Cages for bioassay | Dependent on experimental setup | ||
| Combitips Advanced 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | Optional (if no injector appartus is available) |
| Containers for larval self-removal | Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions) | ||
| Forceps | Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision | ||
| Fume hood | |||
| Incubator | Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | Any absorbent wipe will work |
| Medium-sized weight boats | Serve as inoculum trays | ||
| Microcon-100kDa with Biomax membrane | MilliporeSigma | MPE100025 | |
| NaCl | |||
| Nitrile gloves | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | SigmaAldrich | P5119 | |
| Polyethylene glycol 8000 (PEG) | SigmaAldrich | 1546605 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | Capable of 15,000 x g | ||
| Refrigerated centrifuge | Capable of 21,000 x g | ||
| Repeater M4 Multipipette | Eppendorf | 4982000322 | Optional (if no injector appartus is available) |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000TS1 | |
| RNAse-free water | SigmaAldrich | W4502 | |
| Sucrose | |||
| TES | SigmaAldrich | T1375 |
Riferimenti
- vanEngelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. 103, 80-95 (2010).
- Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), 1255957 (2015).
- Chen, Y. P., et al. Israeli acute paralysis virus: Epidemiology, pathogenesis and implications for honey bee health. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004261 (2014).
- Natsopoulou, M. E., et al. The virulent, emerging genotype B of Deformed wing virus is closely linked to overwinter honey bee worker loss. Scientific Reports. 7 (1), 5242 (2017).
- Grozinger, C. M., Flenniken, M. L. Bee viruses: Ecology, pathogenicity, and impacts. Annual Review of Entomology. 64, 205-226 (2019).
- Maori, E., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with colony collapse disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
- Hunter, W., et al. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), 1001160 (2010).
- Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
- Park, M. G., et al. Development of a Bacillus thuringiensis based dsRNA production platform to control sacbrood virus in Apis cerana. Pest Management Science. 76 (5), 1699-1704 (2020).
- Brutscher, L. M., Daughenbaugh, K. F., Flenniken, M. L. Antiviral defense mechanisms in honey bees. Current Opinion in Insect Science. 10, 71-82 (2015).
- Dolezal, A. G., et al. Interacting stressors matter: Diet quality and virus infection in honey bee health. Royal Society Open Science. 6 (2), 181803 (2019).
- Li, J., et al. Pollen reverses decreased lifespan, altered nutritional metabolism and suppressed immunity in honey bees (Apis mellifera) treated with antibiotics. Journal of Experimental Biology. 222 (7), 202077 (2019).
- Harwood, G. P., Dolezal, A. G. Pesticide – interactions in honey bees: Challenges and opportunities for understanding drivers of bee declines. Viruses. 12 (5), 566 (2020).
- Locke, B., Forsgren, E., De Miranda, J. R. Increased tolerance and resistance to virus infections: A possible factor in the survival of Varroa destructor-resistant honey bees (Apis mellifera). PLoS ONE. 9 (6), 99998 (2014).
- Thaduri, S., Stephan, J. G., de Miranda, J. R., Locke, B. Disentangling host-parasite-pathogen interactions in a varroa-resistant honey bee population reveals virus tolerance as an independent, naturally adapted survival mechanism. Scientific Reports. 9 (1), 6221 (2019).
- Chen, Y., Zhao, Y., Hammond, J., Hsu, H. T., Evans, J., Feldlaufer, M. Multiple virus infections in the honey bee and genome divergence of honey bee viruses. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 84-93 (2004).
- Runckel, C., et al. Temporal analysis of the honey bee microbiome reveals four novel viruses and seasonal prevalence of known viruses, Nosema, and Crithidia. PLoS One. 6 (6), 20656 (2011).
- Carrillo-Tripp, J., et al. In vivo and in vitro infection dynamics of honey bee viruses. Scientific Reports. 6, 22265 (2016).
- Di Prisco, G., et al. Neonicotinoid clothianidin adversely affects insect immunity and promotes replication of a viral pathogen in honey bees. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18466-18471 (2013).
- Degrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Dejong, E. W., Chambers, M. L., Hidalgo, G. Effects of oral exposure to fungicides on honey bee nutrition and virus levels. Journal of Economic Entomology. 108 (6), 2518-2528 (2015).
- Negri, P., et al. Towards precision nutrition: A novel concept linking phytochemicals, immune response and honey bee health. Insects. 10 (11), 10110401 (2019).
- Fürst, M. A., McMahon, D. P., Osborne, J. L., Paxton, R. J., Brown, M. J. F. Disease associations between honey bees and bumblebees as a threat to wild pollinators. Nature. 506 (7488), 364-366 (2014).
- Lamp, B., et al. Construction and rescue of a molecular clone of Deformed wing virus (DWV). PLoS One. 11 (11), 0164639 (2016).
- Gusachenko, O. N., Woodford, L., Balbirnie-Cumming, K., Ryabov, E. V., Evans, D. J. Deformed wing virus spillover from honey bees to bumble bees: A reverse genetic study. bioRxiv. , (2019).
- Ryabov, E. V., et al. Dynamic evolution in the key honey bee pathogen deformed wing virus: Novel insights into virulence and competition using reverse genetics. PLoS Biology. 17 (10), 3000502 (2019).
- Benjeddou, M., Leat, N., Allsopp, M., Davison, S. Development of infectious transcripts and genome manipulation of Black queen-cell virus of honey bees. Journal of General Virology. 83 (12), 3139-3146 (2002).
- Seitz, K., et al. A molecular clone of Chronic Bee Paralysis Virus (CBPV) causes mortality in honey bee pupae (Apis mellifera). Scientific Reports. 9 (1), 16274 (2019).
- Yang, S., et al. A reverse genetics system for the israeli acute paralysis virus and chronic bee paralysis virus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1742 (2020).
- Guo, Y., Goodman, C. L., Stanley, D. W., Bonning, B. C. Cell lines for honey bee virus research. Viruses. 12 (2), 1-17 (2020).
- Goblirsch, M. J., Spivak, M. S., Kurtti, T. J. A cell line resource derived from honey bee (Apis mellifera) embryonic tissues. PLoS One. 8 (7), 69831 (2013).
- Azzami, K., Ritter, W., Tautz, J., Beier, H. Infection of honey bees with acute bee paralysis virus does not trigger humoral or cellular immune responses. Archives of Virology. 157 (4), 689-702 (2012).
- Boncristiani, H. F., et al. In vitro infection of pupae with Israeli acute paralysis virus suggests disturbance of transcriptional homeostasis in honey bees (Apis mellifera). PLoS One. 8 (9), 73429 (2013).
- De Miranda, J. R., et al. Standard methods for virus research in Apis mellifera. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-56 (2013).
- Posada-Florez, F., et al. Deformed wing virus type A, a major honey bee pathogen, is vectored by the mite Varroa destructor in a non-propagative manner. Scientific Reports. 9 (1), 12445 (2019).
- Singh, R., et al. RNA viruses in hymenopteran pollinators: Evidence of inter-taxa virus transmission via pollen and potential impact on non-Apis hymenopteran species. PLoS One. 5 (12), 14357 (2010).
- Fine, J. D., Cox-Foster, D. L., Mullin, C. A. An inert pesticide adjuvant synergizes viral pathogenicity and mortality in honey bee larvae. Scientific Reports. 7, 40499 (2017).
- Palmer-Young, E. C., et al. Nectar and pollen phytochemicals stimulate honey bee (Hymenoptera: Apidae) immunity to viral infection. Journal of Economic Entomology. 110 (5), 1959-1972 (2017).
- Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. 23 (5), 371-378 (2004).
- Hoover, S. E. R., Keeling, C. I., Winston, M. L., Slessor, K. N. The effect of queen pheromones on worker honey bee ovary development. Naturwissenschaften. 90 (10), 477-480 (2003).
- Toth, A. L., Kantarovich, S., Meisel, A. F., Robinson, G. E. Nutritional status influences socially regulated foraging ontogeny in honey bees. Journal of Experimental Biology. 208 (24), 4641-4649 (2005).
- Walton, A., Dolezal, A. G., Bakken, M. A., Toth, A. L. Hungry for the queen: Honey bee nutritional environment affects worker pheromone response in a life stage-dependent manner. Functional Ecology. 32 (12), 2699-2706 (2018).
- Williams, G. R., et al. Standard methods for maintaining adult Apis mellifera in cages under in vitro laboratory conditions. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-36 (2013).
- Robertson, J. L., Olguin, E., Alberts, B., Jones, M. M. . Bioassays with arthropods. , (2007).
- Gauthier, L., et al. The Apis mellifera filamentous virus genome. Viruses. 7 (7), 3798-3815 (2015).
- Hsieh, E. M. Ameliorative effects of phytochemical ingestion on viral infection in honey bees. University of Illinois at Urbana-Champaign. , (2020).
- Zhang, G., St. Clair, A. L., Dolezal, A., Toth, A. L., O’Neal, M. Honey Bee (Hymenoptera: Apidea) pollen forage in a highly cultivated agroecosystem: Limited diet diversity and its relationship to virus resistance. Journal of Economic Entomology. 113 (3), 1062-1072 (2020).
- Geffre, A. C., et al. Honey bee virus causes context-dependent changes in host social behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (19), 10406-10413 (2020).
- Rutter, L., et al. Transcriptomic responses to diet quality and viral infection in Apis mellifera. BMC Genomics. 20 (1), 412 (2019).
