Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) in der Skelettmuskulatur der Ratte
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) aus dem Skelettmuskel der Ratte. Die Verwendung der Ratte in Muskelverletzungsmodellen bietet eine erhöhte Gewebeverfügbarkeit von atrophischen Muskeln für die Analyse und ein größeres Repertoire an validierten Methoden zur Beurteilung von Muskelkraft und Gang bei frei beweglichen Tieren.
Abstract
Fibro-adipogene Vorläufer (FAPs) sind residente interstitielle Zellen in der Skelettmuskulatur, die zusammen mit myogenen Vorläufern (MPs) eine Schlüsselrolle bei der Homöostase, Verletzung und Reparatur von Muskeln spielen. Aktuelle Protokolle zur Identifizierung und Isolierung von FAPs verwenden Durchflusszytometrie/Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) und Studien zur Bewertung ihrer Funktion in vivo wurden bisher ausschließlich an Mäusen durchgeführt. Die größere inhärente Größe der Ratte ermöglicht eine umfassendere Analyse von FAPs in Skelettmuskelverletzungsmodellen, insbesondere bei stark atrophischen Muskeln oder wenn Forscher eine erhebliche Gewebemasse benötigen, um mehrere nachgeschaltete Assays durchzuführen. Die Ratte bietet zusätzlich eine größere Auswahl an Muskelfunktionsassays, die keine Sedierung oder Tötung von Tieren erfordern, wodurch die Morbidität und der Tiereinsatz minimiert werden, indem sie serielle Bewertungen ermöglicht. Die für Mäuse optimierten Durchflusszytometrie/FACS-Protokolle sind speziesspezifisch und insbesondere durch die Eigenschaften kommerziell erhältlicher Antikörper eingeschränkt. Sie wurden nicht für die Trennung von FAPs von Ratten oder stark fibrotischen Muskeln optimiert. Es wurde ein Durchflusszytometrie/FACS-Protokoll zur Identifizierung und Isolierung von FAPs und MPs sowohl aus gesunden als auch aus entferneten Rattenskelettmuskeln entwickelt, das sich auf die differentielle Expression der Oberflächenmarker CD31, CD45, Sca-1 und VCAM-1 stützt. Da rattenspezifische, durchflusszytometrie-validierte primäre Antikörper stark begrenzt sind, wurde eine interne Konjugation des Antikörpers, der auf Sca-1 abzielt, durchgeführt. Mit diesem Protokoll wurde die erfolgreiche Sca-1-Konjugation bestätigt und die durchflusszytometrische Identifizierung von FAPs und MPs durch Zellkultur und Immunfärbung von FACS-isolierten FAPs und MPs validiert. Schließlich berichten wir über einen neuartigen FAPs-Zeitverlauf in einem verlängerten (14 Wochen) Rattendenervierungsmodell. Diese Methode bietet den Forschern die Möglichkeit, FAPs in einem neuartigen Tiermodell zu untersuchen.
Introduction
Fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) sind eine Population von residenten multipotenten Vorläuferzellen in der Skelettmuskulatur, die eine entscheidende Rolle bei der Homöostase, Reparatur und Regeneration von Muskeln spielen und umgekehrt auch pathologische Reaktionen auf Muskelverletzungen vermitteln. Wie der Name schon sagt, wurden FAPs ursprünglich als Vorläuferpopulation mit dem Potenzial identifiziert, sich in Fibroblasten und Adipozyten zu differenzieren1 und galten als die Schlüsselmediatoren der Fibrofettinfiltration der Skelettmuskulatur bei chronischen Verletzungen und Krankheiten. Weitere Studien ergaben, dass FAPs zusätzlich zur Osteogenese und Chondrogenesefähigsind 2,3,4. So werden sie in der Literatur weiter gefasst als mesenchymale oder stromale Vorläufer 3 ,5,6,7,8. Bei akuten Skelettmuskelverletzungen helfen FAPs indirekt bei der regenerativen Myogenese, indem sie sich vorübergehend vermehren, um eine günstige Umgebung für aktivierte Muskelsatellitenzellen und ihre nachgeschalteten myogenen Vorläufer (MPs) -Gegenstücke1,9,10zuschaffen. Parallel zur erfolgreichen Regeneration durchlaufen FAPs eine Apoptose und bringen ihre Anzahl auf die Ausgangswerte1,9,10,11zurück. Im Gegensatz dazu überschreiben FAPs bei chronischen Muskelverletzungen pro-apoptotische Signale, was zu ihrer Persistenz9, 10, 11und abnormaler Muskelreparatur führt.
In vivo-Studien, die die zellulären und molekularen Mechanismen, mit denen FAPs Muskelreaktionen vermitteln, bewerten, haben bis heute murine Tiermodelleverwendet 1,7,9,10,11,12,13,14. Während gentechnisch veränderte Mäuse leistungsfähige Werkzeuge für diese Analysen sind, begrenzt die geringe Größe des Tieres die Gewebeverfügbarkeit für Studien in langfristigen lokalisierten Verletzungsmodellen, in denen Muskelschwund tiefgreifend sein kann, wie z.B. traumatische Denervierung. Darüber hinaus erfordert die Messung der Muskelkraft und der körperlichen Funktion Ex-vivo- oder In-situ-Messungen, die eine Beendigung der Maus erfordern, oder In-vivo-Methoden, die eine Operation und/oder eine Vollnarkose erfordern, um die Beurteilung der kontraktilen Muskelleistung zu ermöglichen15,16,17,18,19,20 . Bei Ratten existieren gut validierte und global genutzte Muskelfunktionsanalysen sowie Analysen für komplexere motorische Verhaltensweisen wie Ganganalysen (z. B. Ischiasfunktionsindex, CatWalk-Analyse) und werden bei wachen und sich spontan bewegenden Tieren durchgeführt21,22,23,24 . Dies optimiert zusätzlich die Prinzipien der minimalen Morbidität im Tierversuch und die Anzahl der verwendeten Versuchstiere. Die Ratte bietet dem FAPs-Forscher dadurch die zusätzliche Flexibilität eines größeren verletzten Muskelvolumens für Protein- und Zellanalysen und die Möglichkeit, serielle Bewertungen der statischen und dynamischen funktionellen Aktivität und des Verhaltens von Muskelkomplexen im Alarmtier durchzuführen.
FAPs wurden in erster Linie identifiziert und aus ganzen Muskelproben mittels Durchflusszytometrie bzw. Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert. Dies sind laserbasierte Assays, die in der Lage sind, mehrere spezifische Zellpopulationen basierend auf charakteristischen Merkmalen wie Größe, Granularität und einer spezifischen Kombination von Zelloberfläche oder intrazellulären Markern zu identifizieren25. Dies ist sehr vorteilhaft bei der Untersuchung eines Organsystems wie der Skelettmuskulatur, da Homöostase und Regeneration komplexe, multifaktorielle Prozesse sind, die von einer Vielzahl von Zelltypen koordiniert werden. Eine bahnbrechende Studie identifizierte SOWOHL FAPs als auch MPs unter Verwendung durchflusszytometrischer Methoden in der Skelettmuskulatur der Maus1. Sie zeigten, dass FAPs mesenchymaler Natur sind, da ihnen Oberflächenantigene fehlten, die für Zellen aus endothelialen (CD31), hämatopoetischen (CD45) oder myogenen (Integrin-α7 [ITGA7]) Ursprüngen spezifisch waren, aber den mesenchymalen Stammzellmarker Sca-1 (Stammzellantigen 1)1 exprimierten und in Kultur in fibrogene und adipogene Zellen differenzierten. Andere Studien zeigten eine erfolgreiche Isolierung von mesenchymalen Vorläuferzellen im Muskel basierend auf der Expression eines alternativen Stammzellmarkers, des aus Thrombozyten abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptors alpha (PDGFRα)2,7,8, und weitere Analysen ergaben, dass es sich wahrscheinlich um die gleiche Zellpopulation wie FAPs3 handelt. FAPs werden jetzt häufig in der Durchflusszytometrie identifiziert, indem entweder Sca-1 oder PDGFRα als positiver Selektionsmarker1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Die Verwendung von PDGFRα ist jedoch für menschliches Gewebe bevorzugt, da ein direkter menschlicher Homolog von murinem Sca-1 noch identifiziert werden muss32. Darüber hinaus wurden andere Zelloberflächenproteine als Marker für MPs (z. B. VCAM-1) berichtet, die eine potenzielle Alternative zu ITGA7 als Indikator für Zellen myogener Abstammung während der FAPs-Isolierung33darstellen.
Während die Durchflusszytometrie / FACS eine leistungsfähige Methodik zur Untersuchung der Rolle und des pathogenen Potenzials von FAPs in der Skelettmuskulatur1,9,10,11,13,29ist sie technisch durch die Spezifität und Optimierung der erforderlichen Reagenzien begrenzt. Da die durchflusszytometrische Identifizierung und Isolierung von FAPs in den Maustiermodellen1,9,10,11,29entwickelt und durchgeführt wurde, stellt dies Forscher, die FAPs in anderen Modellorganismen untersuchen möchten, vor Herausforderungen. Viele Faktoren – wie die optimale zu verarbeitende Gewebegröße sowie die Reagenzien- und/oder Antikörperspezifität und -verfügbarkeit – unterscheiden sich je nach verwendeter Spezies.
Zusätzlich zu den technischen Hindernissen für die Untersuchung von FAPs in einem neuartigen Tiermodell wurden sie weitgehend in einem akuten, toxischen Umfeld untersucht – in der Regel durch intramuskuläre chemische Injektion oder Cardiotoxin. Die Bewertung der langfristigen Dynamik von FAPs beschränkt sich in erster Linie auf die Beurteilung der Duchenne-Muskeldystrophie unter Verwendung des mdx-Mausmodells9,10,11und Modellen von Kombinationsmuskelverletzungen wie massivem Rotatorenmanschettenriss, bei dem gleichzeitige Sehnentransfektion und Denervierung an der Schultermuskulatur durchgeführt wird26,27,28 . Die Reaktion der FAPs auf die alleinige Beleidigung der chronischen traumatischen Denervierung, ein häufiges Auftreten bei Arbeitsunfällen in der Schwerindustrie, der Landwirtschaft und bei Geburtstraumata (Plexus brachialis)34,35,36,37 mit signifikanter Morbidität, wurde nicht so gut charakterisiert, oft auf einen kurzfristigen Zeitrahmen beschränkt11,38.
Wir beschreiben eine Methode zur Identifizierung und Isolierung von FAPs und MPs aus gesunden sowie stark atrophischen und fibrotischen Skelettmuskeln bei der Ratte. Zunächst wird die Identifizierung von CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-FAPs und CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+-MPs unter Verwendung eines Gewebeaufschluss- und Durchflusszytometrie-Färbeprotokolls demonstriert und die anschließende Validierung unserer Ergebnisse erfolgt durch Kultur und immunzytochemische Färbung von FACS-isolierten Zellen. Mit dieser Methode berichten wir auch über einen neuartigen FAPs-Zeitverlauf in einem langfristigen isolierten Denervierungsverletzungsmodell bei der Ratte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein optimiertes, validiertes FAPs-Isolationsprotokoll für den Rattenmuskel ist für Forscher unerlässlich, die Verletzungsmodelle untersuchen möchten, die bei der Maus aus biologischen oder technischen Gründen nicht durchführbar sind. Zum Beispiel sind Mäuse kein optimales Tiermodell, um chronische lokale oder neurodegenerative Verletzungen wie langfristige Denervierung zu untersuchen. Biologisch machen es die kurze Lebensdauer und die schnelle Alterung von Mäusen schwierig, die Muskelsequenzen aufgrund der Denerv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Flow Cytometry Core Facilities an der University of Ottawa und dem Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto, für ihre Expertise und Anleitung bei der Optimierung des in diesem Manuskript vorgestellten Durchflusszytometrie/FACS-Protokolls. Diese Arbeit wurde vom Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) an JB finanziert.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 10 cm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3902 | |
| 12-well cell culture plate | ThermoFisher | 130185 | |
| 12 mm glass coverslips, No.2 | VWR | 89015-724 | |
| 10 mL Syringe | Beckton Dickenson | 302995 | |
| 15 mL centrifuge tubes | FroggaBio | 91014 | |
| 20 gauge needle | Beckton Dickenson | 305176 | |
| 25mL Serological pipette | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| 40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50mL centrifuge tubes | FroggaBio | TB50 | |
| AbC Total Antibody Compensation Beads | ThermoFisher | A10497 | |
| Ammonium Chloride, Reagent Grade | Bioshop | AMC303.500 | |
| APC Conjugation Kit, 50-100µg | Biotium | 92307 | |
| Aquatex Aqueous Mounting Medium | Merck | 108562 | |
| Biolaminin 411 LN | Biolamina | LN411 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Bioshop | ALB001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop | CCL444.500 | |
| Collagenase Type II | Gibco | 17101015 | |
| CountBright Plus Absolute Counting Beads | ThermoFisher | C36995 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 17105041 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | (+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate |
| EDTA | FisherScientific | S311 | |
| FACSClean Solution | Beckton Dickenson | 340345 | |
| FACSDiva Software | Beckton Dickenson | — | |
| FACSRinse Solution | Beckton Dickenson | 340346 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | |
| Flow Cytometry Sheath Fluid | Beckton Dickenson | 342003 | |
| FlowJo Software | Beckton Dickenson | — | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S302380-2 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21424 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | |
| Ham's F10 Media | ThermoFisher | 11550043 | (+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) | Multicell | 311-513-CL | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050-088 | |
| Hemocytometer | Reichert | N/A | |
| HEPES, minimum 99.5% titration | Sigma | H3375 | |
| Horse Serum | ThermoFisher | 16050130 | |
| Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) | Cell Signaling | 8915LF | |
| Humulin R | Lilly | HI0210 | |
| IBMX | Millipore Sigma | I5879 | Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | Also known as 2-propanol |
| Lewis Rat, Female | Charles River Kingston | 004 (Strain Code) | 200-250 grams used |
| LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer | Beckton Dickenson | — | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP-5417R | |
| MoFlo XDP Cell Sorter | Beckman Coulter | — | |
| Mouse Anti-CD31::FITC Antibody | Abcam | ab33858 | Clone TLD-3A12 |
| Mouse Anti-CD45::FITC Antibody | Biolegend | 202205 | Clone OX-1 |
| Mouse Anti-CD106::PE Antibody | Biolegend | 200403 | Also known as VCAM-1 |
| Mouse Anti-MHC Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | Also known as MF20 |
| Mouse Anti-Pax7 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | |
| Neutral Buffered Formalin, 10 % | Sigma | HT501128 | |
| Oil Red O | Millipore Sigma | O0625 | |
| PE-Cy7 Conjugation Kit | Abcam | ab102903 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | (-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride |
| Potassium Bicarbonate, Reagent Grade | Bioshop | PBC401.250 | |
| Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody | Invitrogen | MA5-32347 | FSP-1 also known as S100A4 |
| Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody | Abcam | ab203254 | |
| Rabbit Anti-Laminin Antibody | Sigma | L9393 | |
| Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody | Abcam | ab3526 | |
| Rabbit Anti-Sca-1 Antibody | Millipore Sigma | AB4336 | |
| Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody | Abcam | ab260043 | Also known as Col1a1 |
| Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody | Abcam | ab203491 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Gibco | PHG0266 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Troglitazone | Millipore Sigma | T2573 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510 |
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