Encells multiplexerad fluorescensavbildning för att visualisera virala nukleinsyror och proteiner och övervaka HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus och influensainfektion
Summary
Här presenteras ett protokoll för en fluorescensavbildningsmetod, multiplex immunofluorescerande cell-baserad detektion av DNA, RNA och protein (MICDDRP), en metod som kan samtidig fluorescens encellsvisualisering av viralt protein och nukleinsyror av olika typ och stränghet. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på ett brett spektrum av system.
Abstract
Att fånga de dynamiska replikerings- och monteringsprocesserna för virus har hindrats av bristen på robusta in situ-hybridiseringstekniker (ISH) som möjliggör känslig och samtidig märkning av viral nukleinsyra och protein. Konventionella DNA-fluorescens in situ hybridiseringsmetoder (FISH) är ofta inte kompatibla med immunfärgning. Vi har därför utvecklat en avbildningsmetod, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), som möjliggör samtidig encellsvisualisering av DNA, RNA och protein. Jämfört med konventionell DNA FISH använder micddrp grenad DNA (bDNA) ISH-teknik, vilket dramatiskt förbättrar oligonukleotidsondkänsligheten och detektionen. Små modifieringar av MICDDRP möjliggör avbildning av virala proteiner samtidigt med nukleinsyror (RNA eller DNA) med olika stränghet. Vi har tillämpat dessa protokoll för att studera livscyklerna för flera virala patogener, inklusive humant immunbristvirus (HIV)-1, humant T-lymfotropt virus (HTLV)-1, hepatit B-virus (HBV), hepatit C-virus (HCV), Zika-virus (ZKV) och influensa A-virus (IAV). Vi visade att vi effektivt kan märka virala nukleinsyror och proteiner över ett brett spektrum av virus. Dessa studier kan ge oss förbättrad mekanistisk förståelse av flera virala system och dessutom fungera som en mall för tillämpning av multiplexerad fluorescensavbildning av DNA, RNA och protein över ett brett spektrum av cellulära system.
Introduction
Medan tusentals kommersiella antikroppar är tillgängliga för att specifikt märka proteiner via konventionella immunfärgningsmetoder, och medan fusionsproteiner kan konstrueras med fotooptimerade fluorescerande taggar för att spåra flera proteiner i ett prov1, är mikroskopisk visualisering av protein ofta inte kompatibel med konventionell DNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH)2 . Tekniska begränsningar i samtidig visualisering av DNA, RNA och protein med hjälp av fluorescensbaserade metoder har hindrat fördjupad förståelse av virusreplikation. Spårning av både viral nukleinsyra och protein under infektionsförloppet gör det möjligt för virologer att visualisera grundläggande processer som ligger under virusreplikation och montering 3,4,5,6.
Vi har utvecklat en avbildningsmetod, multiplex immunofluorescent cell-baserad detektion av DNA, RNA och Protein (MICDDRP)3, som använder grenat DNA (bDNA) in situ-teknik för att förbättra känsligheten för nukleinsyradetektering 7,8,9 . Dessutom använder denna metod parade sonder för förbättrad specificitet. bDNA-sekvensspecifika sonder använder förgreningsförförstärkare och förstärkar-DNA för att producera en intensiv och lokaliserad signal, vilket förbättrar tidigare hybridiseringsmetoder som förlitade sig på att rikta in sig på upprepade regioner i DNA9. Infekterade celler i ett kliniskt sammanhang innehåller ofta inte rikligt med viralt genetiskt material, vilket ger en vara för en känslig metod för fluorescerande nukleinsyradetektering i diagnostiska miljöer. Kommersialiseringen av bDNA-teknik genom tillvägagångssätt som RNAscope7 och ViewRNA10 har fyllt denna nisch. Känsligheten hos bDNA-fluorescensavbildning har också viktig nytta i cellbiologi, vilket möjliggör detektion av knappa nukleinsyraarter i cellodlingsmodeller. Den stora förbättringen av känsligheten gör bDNA-baserade avbildningsmetoder lämpliga för att studera virus. En potentiell brist är dock att dessa metoder fokuserar på att visualisera RNA eller RNA och protein. Alla replikerande celler och många virus har DNA-genom eller bildar DNA under sin replikationscykel, vilket gör metoder som kan avbilda både RNA och DNA, såväl som protein, mycket önskvärda.
I MICDDRP-protokollet utför vi bDNA FISH för detektion av viral nukleinsyra med hjälp av RNAscope-metoden, med modifieringar7. En av de viktigaste modifieringarna av detta protokoll är optimering av proteasbehandling efter kemisk fixering. Proteasbehandling underlättar avlägsnande av proteiner bundna till nukleinsyra för att förbättra sondhybridiseringseffektiviteten. Protasbehandling följs av inkubation med grenade oligonukleotidsonder. Efter applicering av bDNA-sond tvättas prover och inkuberas därefter med signalförförstärkare och förstärkar-DNA. Multiplexerad in situ-hybridisering (ISH), märkning av flera genmål, kräver målprober med olika färgkanaler för spektraldifferentiering7. Inkubation med DNA-förstärkare följs av immunofluorescens (IF).
bDNA ISH ger förbättringar av signal-till-brus genom förstärkning av målspecifika signaler, med en minskning till bakgrundsbrus från icke-specifika hybridiseringshändelser 7,11. Målprober är utformade med hjälp av program som är allmänt tillgängliga och som förutsäger sannolikheten för icke-specifika hybridiseringshändelser, samt beräknar smälttemperatur (Tm) för sondmålhybriden 7,11. Målprober innehåller en 18- till 25-basregion som kompletterar mål-DNA / RNA-sekvensen, en distanssekvens och en 14-bas svanssekvens. Ett par målprober, var och en med en distinkt svanssekvens, hybridiseras till ett målområde (som sträcker sig över ~ 50 baser). De två svanssekvenserna bildar ett hybridiseringsställe för förförstärkarproberna, som innehåller 20 bindningsställen för förstärkarsonderna, som dessutom innehåller 20 bindningsställen för etikettsonden. Som ett exempel riktas en kilobas (kb) region på nukleinsyramolekylen av 20 sondpar, vilket skapar en molekylär ställning för sekventiell hybridisering med förförstärkaren, förstärkaren och etikettsonden. Detta kan således leda till ett teoretiskt utbyte på 8000 fluorescerande etiketter per nukleinsyramolekyl, vilket möjliggör detektion av enskilda molekyler och stora förbättringar jämfört med konventionella FISH-metoder7 (se figur 1A för schematisk för bDNA-signalförstärkning). Om du vill ställa in sonder för multiplexerad ISH måste varje målsond finnas i en annan färgkanal (C1, C2 eller C3). Dessa målprober med olika färgkanaler har distinkta 14-bassvanssekvenser. Dessa svanssekvenser kommer att binda distinkta signalförstärkare med olika fluorescerande sonder, vilket möjliggör enkel spektral differentiering över flera mål. I det presenterade protokollet, tabell 4 i steg 9, ges ytterligare information om fluorescerande märkning av målprober. Dessutom ger figur 2 och figur 3 exempel på hur vi valde lämplig förstärkare 4-FL (A, B eller C) (fluorescerande sond och det sista hybridiseringssteget) för att uppnå specifik fluorescerande märkning av flera virala nukleinsyramål efter HIV-1- och HTLV-1-infektioner.
Vi har demonstrerat flera tillämpningar av samtidig fluorescensvisualisering av RNA, DNA och proteiner och observerat kritiska stadier av virusreplikation med hög spatiotemporal upplösning 3,4,5. Till exempel har samtidig encellsvisualisering av viralt RNA, cytoplasmatiskt och nukleärt DNA och protein gjort det möjligt för oss att visualisera viktiga händelser under HIV-1-infektion, inklusive följande RNA-innehållande kärnor i cytoplasman före kärninträde och integration av proviralt DNA3. Dessutom har vi tillämpat MICDDRP för att karakterisera effekterna av värdfaktorer och läkemedelsbehandling på virusinfektion och replikation 4,5. I Ukah et al., spårade vi reaktivering av HIV-1-transkription i latenscellmodeller behandlade med olika latens-reverserande medel för att visualisera HIV-transkription och latensomvandling4. Dessutom kan MICDDRP tillåta oss att visualisera fenotypiska förändringar associerade med antiviral hämning som tillskrivs småmolekylbehandling eller värdfaktorbegränsning. Som ett bevis på konceptet för robustheten och den breda tillämpligheten av vårt tillvägagångssätt har vi visat att vi kan använda modifieringar av vårt protokoll för att effektivt märka viral nukleinsyra för att följa infektion inte bara i humant immunbristvirus (HIV) -1, utan också humant T-lymfotropt virus (HTLV) -1, hepatit B-virus (HBV), hepatit C-virus (HCV), Zikavirus (ZIKV) och influensa A-virus (IAV). Eftersom HIV-1-livscykeln består av både viralt DNA och RNA-arter har vi utfört majoriteten av vår optimering av MICDDRP efter HIV-1-replikationskinetik. Men dessutom har vi visat att vi kan spåra syntes av olika virala RNA-transkript av endera eller båda sense (+) och antisense (-) stränglighet i virus som ZIKV, IAV, HBV och HCV för att övervaka viral transkription och replikation 3,4,5,6. Studierna syftar till att förbättra den mekanistiska förståelsen av flera virala processer och fungera som en riktlinje för att implementera denna fluorescensavbildningsteknik till ett brett spektrum av cellulära modeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Samtidig visualisering av RNA, DNA och protein kräver ofta omfattande optimering. Två vanliga metoder är 5-etynyl-2-deoxiuridin (EdU) märkning och DNA FISH. EdU-märkning har tillämpats för att visualisera viralt DNA och protein samtidigt, eftersom EdU införlivas i begynnande DNA och därefter märks med azidinnehållande fluorescerande färgämnen via klickkemi. EdU-märkning kan således användas för att övervaka infödd virusreplikationskinetik av DNA-virus eller virus med DNA-mallar för replikerin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes helt eller delvis av National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 och U54 AI150472). Vi tackar Dr. Raymond F. Schinazi och Sadie Amichai för att tillhandahålla celler infekterade med influensa A-virus.
Materials
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
Riferimenti
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
- Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
- Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
- Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
- Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
- Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
- Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).
