Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme
Summary
Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein’in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.
Abstract
Virüslerin dinamik replikasyon ve montaj süreçlerini yakalamak, viral nükleik asit ve proteinin hassas ve eşzamanlı olarak etiketlenmesini sağlayan sağlam in situ hibridizasyon (ISH) teknolojilerinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Konvansiyonel DNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) yöntemleri genellikle immün boyama ile uyumlu değildir. Bu nedenle, DNA, RNA ve proteinin eşzamanlı tek hücreli görselleştirmesini sağlayan MICDDRP (MULTIPLEX IMMUNOFLUORESCENT CELL-BASED D ETECTION OF DNA, RNA ve protein) adlı bir görüntüleme yaklaşımı geliştirdik. Geleneksel DNA FISH’lerle karşılaştırıldığında, micddrp, oligonükleotid probu duyarlılığını ve tespitini önemli ölçüde artıran dallanmış DNA (bDNA) ISH teknolojisini kullanır. MICDDRP’nin küçük modifikasyonları, viral proteinlerin farklı sarmallara sahip nükleik asitlerle (RNA veya DNA) eşzamanlı olarak görüntülenmesini sağlar. Bu protokolleri, insan immün yetmezlik virüsü (HIV)-1, insan T-lenfotropik virüsü (HTLV)-1, hepatit B virüsü (HBV), hepatit C virüsü (HCV), Zika virüsü (ZKV) ve influenza A virüsü (IAV) dahil olmak üzere çoklu viral patojenlerin yaşam döngülerini incelemek için uyguladık. Viral nükleik asitleri ve proteinleri çeşitli virüslerde etkili bir şekilde etiketleyebileceğimizi gösterdik. Bu çalışmalar bize çoklu viral sistemlerin gelişmiş mekanik anlayışını sağlayabilir ve ek olarak, DNA, RNA ve proteinin çok katlı floresan görüntülemesinin geniş bir hücresel sistem spektrumunda uygulanması için bir şablon görevi görebilir.
Introduction
Geleneksel immün boyama yaklaşımlarıyla proteinleri spesifik olarak etiketlemek için binlerce ticari antikor mevcut olsa da ve füzyon proteinleri, bir örnek1’deki birden fazla proteini izlemek için foto-optimize floresan etiketlerle tasarlanabilirken, proteinin mikroskobik görselleştirilmesi genellikle geleneksel DNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH) ile uyumlu değildir2 . Floresan tabanlı yaklaşımlar kullanılarak DNA, RNA ve proteinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesindeki teknik sınırlamalar, virüs replikasyonunun derinlemesine anlaşılmasını engellemiştir. Enfeksiyon sırasında hem viral nükleik asidin hem de proteinin izlenmesi, virologların virüs replikasyonu ve montajı 3,4,5,6’nın altında yatan temel süreçleri görselleştirmelerini sağlar.
Nükleik asit tespitinin duyarlılığını artırmak için dallanmış DNA (bDNA) in situ teknolojisini kullanan DNA, RNA ve Protein’in (MICDDRP)3’ün multiplex immunofloresan cell tabanlı detection’u adlı bir görüntüleme yaklaşımı geliştirdik 7,8,9 . Ek olarak, bu yöntem gelişmiş özgüllük için eşleştirilmiş problar kullanır. bDNA dizisine özgü problar, yoğun ve lokalize bir sinyal üretmek için dallanma preamplifikatörü ve amplifikatör DNA’larını kullanır ve DNA9’da tekrarlanan bölgeleri hedeflemeye dayanan önceki hibridizasyon yöntemlerini geliştirir. Klinik bağlamda enfekte olmuş hücreler genellikle bol miktarda viral genetik materyal içermez ve tanısal ortamlarda floresan nükleik asit tespiti için hassas bir yöntem için bir emtia sağlar. bDNA teknolojisinin RNAscope7 ve ViewRNA10 gibi yaklaşımlarla ticarileştirilmesi bu nişi doldurmuştur. bDNA floresan görüntülemenin duyarlılığı, hücre kültürü modellerinde kıt nükleik asit türlerinin tespit edilmesine izin veren hücre biyolojisinde de önemli bir faydaya sahiptir. Duyarlılığın büyük ölçüde artması, bDNA tabanlı görüntüleme yöntemlerini virüsleri incelemek için uygun hale getirir. Bununla birlikte, potansiyel bir eksiklik, bu yöntemlerin RNA veya RNA ve proteini görselleştirmeye odaklanmasıdır. Tüm çoğalan hücreler ve birçok virüs, DNA genomlarına sahiptir veya replikasyon döngüleri sırasında DNA oluşturur, bu da hem RNA hem de DNA’yı ve proteini görüntüleyebilen yöntemleri oldukça arzu edilir hale getirir.
MICDDRP protokolünde, RNAscope yöntemini kullanarak viral nükleik asidin tespiti için bDNA FISH’imodifikasyonlar 7 ile gerçekleştiriyoruz. Bu protokoldeki en önemli değişikliklerden biri, kimyasal fiksasyonu takiben proteaz tedavisinin optimizasyonudur. Proteaz tedavisi, prob hibridizasyon verimliliğini artırmak için nükleik aside bağlı proteinlerin uzaklaştırılmasını kolaylaştırır. Proteaz tedavisini dallı oligonükleotid prob (lar) ile inkübasyon izler. bDNA problarının uygulanmasından sonra, numuneler yıkanır ve daha sonra sinyal ön amplifikatörü ve amplifikatör DNA’ları ile inkübe edilir. Çoklu gen hedeflerinin etiketlenmesi olan multipleks in situ hibridizasyon (ISH), spektral farklılaşma için farklı renk kanallarına sahip hedef problar gerektirir7. DNA amplifikatörleri ile inkübasyonu immünofloresan (IF) takip eder.
bDNA ISH, hedefe özgü sinyallerin amplifikasyonu ile sinyalden gürültüye iyileştirmeler sağlar ve spesifik olmayan hibridizasyon olaylarından kaynaklanan arka plan gürültüsüne bir azalmasağlar 7,11. Hedef problar, spesifik olmayan hibridizasyon olaylarının olasılığını tahmin eden ve prob-hedef hibrid 7,11’in erime sıcaklığını (T m) hesaplayan halka açık yazılım programları kullanılarak tasarlanmıştır. Hedef problar, hedef DNA / RNA dizisini tamamlayan 18 ila 25 bazlı bir bölge, bir ara dizi ve 14 bazlı bir kuyruk dizisi içerir. Her biri ayrı bir kuyruk dizisine sahip bir çift hedef prob, bir hedef bölgeye (~ 50 baza yayılan) melezleşir. İki kuyruk dizisi, amplifikatör probları için 20 bağlama bölgesi içeren ön amplifikatör probları için bir hibridizasyon bölgesi oluşturur ve bunlara ek olarak etiket probu için 20 bağlama bölgesi içerir. Örnek olarak, nükleik asit molekülü üzerindeki bir kilobaz (kb) bölgesi, 20 prob çifti tarafından hedeflenir ve ön amplifikatör, amplifikatör ve etiket probu ile sıralı hibridizasyon için moleküler bir iskele oluşturur. Bu nedenle, nükleik asit molekülü başına 8000 floresan etiketin teorik verimine yol açabilir, bu da tek moleküllerin tespitini ve geleneksel FISH yaklaşımları7’ye göre büyük gelişmeler sağlar (bDNA sinyal amplifikasyonunun şeması için Şekil 1A’ya bakınız). Çoklanmış ISH için problar kurmak üzere her hedef probun farklı bir renk kanalında (C1, C2 veya C3) olması gerekir. Farklı renk kanallarına sahip bu hedef problar, farklı 14 tabanlı kuyruk dizilerine sahiptir. Bu kuyruk dizileri, farklı floresan problarla farklı sinyal amplifikatörlerini bağlayacak ve böylece birden fazla hedef arasında kolay spektral farklılaşmayı mümkün kılacaktır. Sunulan Protokolde, Adım 9’daki Tablo 4, hedef probların floresan olarak etiketlenmesi hakkında daha fazla bilgi sağlar. Ek olarak, Şekil 2 ve Şekil 3, HIV-1 ve HTLV-1 enfeksiyonlarını takiben çoklu viral nükleik asit hedeflerinin spesifik floresan etiketlemesini elde etmek için uygun Amplifikatör 4-FL (A, B veya C) (floresan probu ve son hibridizasyon adımı) ‘nı nasıl seçtiğimize dair örnekler sunmaktadır.
RNA, DNA ve proteinlerin eşzamanlı floresan görselleştirmesinin çeşitli uygulamalarını gösterdik ve yüksek uzaysal zamansal çözünürlük 3,4,5 ile virüs replikasyonunun kritik aşamalarını gözlemledik. Örneğin, viral RNA, sitoplazmik ve nükleer DNA ve proteinin eşzamanlı tek hücreli görselleştirmesi, nükleer girişten önce sitoplazmada RNA içeren çekirdekleri takip etmek ve proviral DNA3’ün entegrasyonu da dahil olmak üzere HIV-1 enfeksiyonu sırasındaki önemli olayları görselleştirmemize izin vermiştir. Ayrıca konakçı faktörlerin ve ilaç tedavisinin viral enfeksiyon ve replikasyon üzerine etkilerini karakterize etmek için MICDDRP uyguladık 4,5. Ukah ve ark.’da, HIV transkripsiyonunu ve gecikme tersine çevirmesini görselleştirmek için farklı gecikme tersine çevirici ajanlarla tedavi edilen gecikmeli hücre modellerinde HIV-1 transkripsiyonunun reaktivasyonunu izledik4. Ek olarak, MICDDRP, küçük molekül tedavisine veya konakçı faktörü kısıtlamasına atfedilen antiviral inhibisyonla ilişkili fenotipik değişiklikleri görselleştirmemize izin verebilir. Yaklaşımımızın sağlamlığına ve geniş uygulanabilirliğine kavramın bir kanıtı olarak, sadece insan immün yetmezlik virüsünde (HIV)-1’de değil, aynı zamanda insan T-lenfotropik virüsünde (HTLV)-1, hepatit B virüsünde (HBV), hepatit C virüsünde (HCV) enfeksiyonu takip etmek için viral nükleik asidi etkili bir şekilde etiketlemek için protokolümüzün modifikasyonlarını kullanabileceğimizi gösterdik. Zika virüsü (ZIKV) ve influenza A virüsü (IAV). HIV-1 yaşam döngüsü hem viral DNA hem de RNA türlerinden oluştuğundan, HIV-1 replikasyon kinetiğini takiben MICDDRP optimizasyonumuzun çoğunu gerçekleştirdik. Bununla birlikte, ek olarak, viral transkripsiyon ve replikasyonu izlemek için ZIKV, IAV, HBV ve HCV gibi virüslerde her iki duyu (+) ve antisens (-) sarmallılığın farklı viral RNA transkriptlerinin sentezini izleyebileceğimizi gösterdik 3,4,5,6. Çalışmalar, çeşitli viral süreçlerin mekanik anlayışını geliştirmeyi ve bu floresan görüntüleme teknolojisini çok çeşitli hücresel modellere uygulamak için bir kılavuz görevi görmeyi amaçlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA, DNA ve proteinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesi genellikle kapsamlı optimizasyon gerektirir. Yaygın olarak kullanılan iki yöntem 5-etinil-2-deoksiüridin (EdU) etiketleme ve DNA FISH’tir. EdU etiketlemesi, viral DNA ve proteini aynı anda görselleştirmek için uygulanmıştır, çünkü EdU yeni ortaya çıkan DNA’ya dahil edilir ve daha sonra tıklama kimyası yoluyla azid içeren floresan boyalarla etiketlenir. Bu nedenle EdU etiketlemesi, DNA virüslerinin veya virüslerin yerel virüs rep…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma tamamen veya kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 ve U54 AI150472) tarafından desteklenmiştir. Dr. Raymond F. Schinazi ve Sadie Amichai’ye influenza A Virüsü ile enfekte olmuş hücreleri sağladıkları için teşekkür ederiz.
Materials
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
Riferimenti
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
- Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
- Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
- Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
- Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
- Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
- Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).
