바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징
Summary
여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.
Abstract
바이러스의 동적 복제 및 조립 프로세스를 캡처하는 것은 바이러스 핵산 및 단백질의 민감하고 동시 표지를 가능하게 하는 강력한 현장 혼성화(ISH) 기술의 부족으로 인해 방해를 받았습니다. 기존의 DNA 형광 제자리 혼성화(FISH) 방법은 종종 면역염색과 호환되지 않습니다. 따라서 우리는 DNA, RNA 및 단백질의 동시 단일 세포 시각화를 가능하게하는 이미징 접근법 인 MICDDRP (DNA, R NA 및 protein의 궁극적 인 형광 c ell 기반dtection)를 개발했습니다. 기존의 DNA FISH와 비교하여 MICDRP는 분지 DNA(bDNA) ISH 기술을 활용하여 올리고뉴클레오티드 프로브 감도와 검출을 크게 향상시킵니다. MICDDRP의 작은 변형은 다른 가닥의 핵산 (RNA 또는 DNA)과 함께 바이러스 단백질의 이미징을 가능하게합니다. 우리는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) -1, 인간 T- 림프 트로픽 바이러스 (HTLV) -1, B 형 간염 바이러스 (HBV), C 형 간염 바이러스 (HCV), 지카 바이러스 (ZKV) 및 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)를 포함한 여러 바이러스 병원체의 수명주기를 연구하기 위해 이러한 프로토콜을 적용했습니다. 우리는 다양한 범위의 바이러스에 걸쳐 바이러스 핵산과 단백질을 효율적으로 라벨링할 수 있음을 입증했습니다. 이러한 연구는 여러 바이러스 시스템에 대한 향상된 기계론적 이해를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 광범위한 세포 시스템에 걸쳐 DNA, RNA 및 단백질의 다중 형광 이미징을 적용하기 위한 템플릿 역할을 할 수 있습니다.
Introduction
기존의 면역염색 접근법을 통해 수천 개의 상용 항체를 사용하여 단백질을 특이적으로 표지할 수 있고, 융합 단백질은 샘플1에서 여러 단백질을 추적하기 위해 광최적화된 형광 태그로 조작할 수 있지만, 단백질의 현미경 시각화는 기존의 DNA 형광 제자리 혼성화(FISH)와 호환되지 않는 경우가 많습니다.2 . 형광 기반 접근법을 사용하여 DNA, RNA 및 단백질을 동시에 시각화하는 기술적 한계로 인해 바이러스 복제에 대한 심층적인 이해가 방해를 받았습니다. 감염 과정에서 바이러스 핵산과 단백질을 모두 추적하면 바이러스 학자가 바이러스 복제 및 조립 3,4,5,6의 기초가되는 기본 프로세스를 시각화 할 수 있습니다.
당사는 핵산 검출의 민감도를 향상시키기 위해 분지형 DNA(bDNA) in situ 기술을 활용하는 D NA, RNA및 P로테인(MICDDRP)3의 궁극적인 형광 c ell 기반 이미징접근법을 개발했습니다.7,8,9 . 또한이 방법은 특이성을 높이기 위해 쌍을 이루는 프로브를 사용합니다. bDNA 서열 특이적 프로브는 분지 전치 증폭기 및 증폭기 DNA를 사용하여 강렬하고 국부적인 신호를 생성하여 DNA9의 반복 영역을 표적화하는 데 의존했던 이전의 혼성화 방법을 개선합니다. 임상 맥락에서 감염된 세포는 종종 풍부한 바이러스 유전 물질을 포함하지 않아 진단 환경에서 형광 핵산 검출을 위한 민감한 방법을 위한 상품을 제공합니다. RNAscope7 및 ViewRNA10과 같은 접근 방식을 통한 bDNA 기술의 상용화는 이러한 틈새 시장을 채웠습니다. bDNA 형광 이미징의 감도는 세포 생물학에서도 중요한 유용성을 가지며, 세포 배양 모델에서 부족한 핵산 종을 검출할 수 있습니다. 감도의 엄청난 향상으로 bDNA 기반 이미징 방법은 바이러스 연구에 적합합니다. 그러나 잠재적인 단점은 이러한 방법이 RNA 또는 RNA 및 단백질을 시각화하는 데 초점을 맞춘다는 것입니다. 모든 복제 세포와 많은 바이러스는 복제 주기 동안 DNA 게놈을 가지고 있거나 DNA를 형성하므로 단백질뿐만 아니라 RNA와 DNA를 모두 이미징할 수 있는 방법이 매우 바람직합니다.
MICDDRP 프로토콜에서 우리는 RNAscope 방법을 사용하여 바이러스 핵산 검출을 위해 bDNA FISH를 수행하며 수정7을 수행합니다. 이 프로토콜의 주요 수정 사항 중 하나는 화학적 고정 후 프로테아제 처리의 최적화입니다. 프로테아제 처리는 핵산에 결합된 단백질의 제거를 용이하게 하여 프로브 혼성화 효율을 개선합니다. 프로테아제 치료 후 분지형 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 인큐베이션이 이어집니다. bDNA 프로브(들)를 적용한 후, 샘플을 세척한 후 신호 전치 증폭기 및 증폭기 DNA와 함께 배양합니다. 여러 유전자 표적의 표지인 다중화 현장 혼성화(ISH)에는 스펙트럼 분화를 위해 서로 다른 색상 채널을 가진 표적 프로브가 필요합니다7. DNA 증폭기를 사용한 배양 후 면역 형광법 (IF)이 뒤 따른다.
bDNA ISH는 비특이적 혼성화 이벤트7,11로 인한 배경 잡음의 감소와 함께 표적 특이적 신호의 증폭에 의해 신호 대 잡음의 개선을 제공합니다. 표적 프로브는 비특이적 혼성화 이벤트의 확률을 예측하고 프로브-표적 하이브리드 7,11의 용융 온도(Tm)를 계산하는 공개적으로 사용 가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 설계되었습니다. 표적 프로브는 표적 DNA/RNA 서열, 스페이서 서열 및 14-염기 꼬리 서열에 상보적인 18-25-염기 영역을 포함합니다. 각각 뚜렷한 꼬리 서열을 가진 한 쌍의 표적 프로브는 표적 영역(~50개 염기에 걸쳐)에 혼성화됩니다. 두 개의 테일 시퀀스는 전-증폭기 프로브에 대한 혼성화 부위를 형성하며, 여기에는 증폭기 프로브에 대한 20개의 결합 부위가 포함되고, 이 결합 부위는 라벨 프로브에 대한 20개의 결합 부위를 추가로 포함합니다. 예를 들어, 핵산 분자의 1킬로베이스(kb) 영역은 20개의 프로브 쌍에 의해 표적화되어 전치 증폭기, 증폭기 및 라벨 프로브와의 순차적 혼성화를 위한 분자 스캐폴드를 생성합니다. 따라서 이는 핵산 분자당 8000개의 형광 표지의 이론적 수율로 이어질 수 있으며, 단일 분자의 검출을 가능하게 하고 기존 FISH 접근법7에 비해 크게 개선될 수 있습니다(bDNA 신호 증폭의 도식도는 그림 1A 참조). 멀티플렉스 ISH에 대한 프로브를 설정하려면 각 대상 프로브가 서로 다른 색상 채널(C1, C2 또는 C3)에 있어야 합니다. 서로 다른 색상 채널을 가진 이러한 표적 프로브는 뚜렷한 14-염기 꼬리 시퀀스를 가지고 있습니다. 이러한 테일 시퀀스는 서로 다른 형광 프로브와 별개의 신호 증폭기를 결합하여 여러 대상에서 스펙트럼을 쉽게 차별화할 수 있습니다. 제시된 프로토콜에서, 단계 9의 표 4는 형광 표지 표적 프로브에 대한 추가 정보를 제공한다. 또한 그림 2와 그림 3은 HIV-1 및 HTLV-1 감염 후 여러 바이러스 핵산 표적의 특정 형광 표지를 달성하기 위해 적절한 Amplifier 4-FL(A, B 또는 C)(형광 프로브 및 최종 혼성화 단계)을 선택한 방법의 예를 제공합니다.
우리는 RNA, DNA 및 단백질의 동시 형광 시각화의 여러 응용 프로그램을 시연하여 높은 시공간 분해능 3,4,5로 바이러스 복제의 중요한 단계를 관찰했습니다. 예를 들어, 바이러스 RNA, 세포질 및 핵 DNA, 단백질의 동시 단일 세포 시각화를 통해 핵 진입 및 프로 바이러스 DNA3의 통합 전에 세포질에 코어를 포함하는 RNA를 추적하는 것을 포함하여 HIV-1 감염 중 주요 이벤트를 시각화 할 수있었습니다. 또한 MICDDRP를 적용하여 바이러스 감염및 복제 4,5에 대한 숙주 인자 및 약물 치료의 효과를 특성화했습니다. Ukah et al.에서는 HIV 전사 및 잠복기 역전을 시각화하기 위해 다양한 잠복기 역전제로 처리된 잠복기 세포 모델에서 HIV-1 전사의 재활성화를 추적했습니다4. 또한 MICDDRP를 사용하면 소분자 치료 또는 숙주 인자 제한에 기인하는 항 바이러스 억제와 관련된 표현형 변화를 시각화 할 수 있습니다. 우리 접근 방식의 견고성과 광범위한 적용 가능성에 대한 개념 증명으로, 우리는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) -1뿐만 아니라 인간 T- 림프 트로픽 바이러스 (HTLV) -1, B 형 간염 바이러스 (HBV), C 형 간염 바이러스 (HCV), 지카 바이러스 (ZIKV) 및 인플루엔자 A 바이러스 (IAV). HIV-1 수명 주기는 바이러스 DNA와 RNA 종으로 구성되어 있기 때문에 HIV-1 복제 역학에 따라 MICDDRP 최적화의 대부분을 수행했습니다. 그러나 또한 ZIKV, IAV, HBV 및 HCV와 같은 바이러스에서 센스(+) 및 안티센스(-) 가닥 중 하나 또는 둘 다의 서로 다른 바이러스 RNA 전사체의 합성을 추적하여 바이러스 전사및 복제 3,4,5,6을 모니터링할 수 있음을 입증했습니다. 이 연구는 여러 바이러스 과정에 대한 기계론적 이해를 개선하고 이 형광 이미징 기술을 광범위한 세포 모델에 구현하기 위한 지침 역할을 하는 것을 목표로 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA, DNA 및 단백질의 동시 시각화에는 종종 광범위한 최적화가 필요합니다. 일반적으로 사용되는 두 가지 방법은 5-에티닐-2-데옥시우리딘(EdU) 표지와 DNA FISH입니다. EdU 라벨링은 EdU가 초기 DNA에 통합되고 클릭 화학을 통해 아지드 함유 형광 염료로 라벨링되기 때문에 바이러스 DNA와 단백질을 동시에 시각화하는 데 적용되었습니다. 따라서, EdU 표지는 복제12를 위한 DNA 주형?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 국립 보건원 (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 및 U54 AI150472)에서 전체 또는 부분적으로 지원했습니다. 인플루엔자 A 바이러스에 감염된 세포를 제공한 Raymond F. Schinazi 박사와 Sadie Amichai 박사에게 감사드립니다.
Materials
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
Riferimenti
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
- Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
- Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
- Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
- Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
- Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
- Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).
