Summary
Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.
Abstract
Der Feuerbrat Thermobia domestica ist eine ametabolöse, flügellose Art, die sich für die Untersuchung der Entwicklungsmechanismen von Insekten eignet, die zu ihrer erfolgreichen evolutionären Strahlung auf der Erde geführt haben. Die Anwendung genetischer Werkzeuge wie der Genombearbeitung ist der Schlüssel zum Verständnis genetischer Veränderungen, die für evolutionäre Übergänge in einem Evo-Devo-Ansatz verantwortlich sind. In diesem Artikel beschreiben wir unser aktuelles Protokoll zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme von T. domestica. Wir berichten von einer Trockeninjektionsmethode als Alternative zur gemeldeten Nassinjektionsmethode, die es uns ermöglicht, stabil hohe Überlebensraten bei injizierten Embryonen zu erhalten. Wir berichten auch über eine optimierte Umgebungseinstellung, um Erwachsene zu paaren und nachfolgende Generationen mit hoher Effizienz zu erhalten. Unsere Methode unterstreicht, wie wichtig es ist, die einzigartige Biologie jeder Art für die erfolgreiche Anwendung von Genombearbeitungsmethoden auf nicht-traditionelle Modellorganismen zu berücksichtigen. Wir sagen voraus, dass diese Genom-Editing-Protokolle bei der Implementierung von T. domestica als Labormodell helfen und die Entwicklung und Anwendung nützlicher genetischer Werkzeuge in dieser Spezies weiter beschleunigen werden.
Introduction
Thermobia domestica gehört zu einem der basalsten Insektenorden, Zygentoma, das einen uralten ametabolen und flügellosen Lebenszyklus behält. Eine solche basale phylogenetische Position und Ahneneigenschaften setzen diese Art als ein attraktives Modell für die Untersuchung der Mechanismen, die dem Erfolg von Insekten auf der Erde zugrunde liegen, die über 70% der beschriebenen Tierarten abdecken1. T. domestica wird seit langem hauptsächlich zur Untersuchung der Urmerkmale der Insektenphysiologie verwendet, da sie als Labormodell geeignet ist, wie z. B. einen relativ kurzen Lebenszyklus (2,5–3,0 Monate vom Embryo bis zum reproduktiven Erwachsenen; Abbildung 1A) und eine einfache Zucht. In den letzten drei Jahrzehnten wurde seine Verwendung erweitert, um ahnende Eigenschaften verschiedener Merkmale wie Körperplan, neuronale Differenzierung und zirkadiane Rhythmen2,3,4zu untersuchen.
Die Anwendung fortschrittlicher genetischer Werkzeuge in T. domestica könnte solche Beiträge in einem weiten Forschungsgebiet weiter beschleunigen. Erfolgreiche RNA-Interferenz (RNAi)-vermittelter Gen-Knockdown bei Embryonen, Nymphen und Erwachsenen wurde in T. domestica4,5,6berichtet. Die Effizienz von systemischen RNAi ist immer noch stark artenabhängig – zum Beispiel ist sie in coleoptera im Allgemeinen hoch, während sie in der Lepidoptera-Ordnung7niedrig ist. Die Effizienz und Dauer des RNAi-Knockdowns in T. domestica muss noch bewertet werden. Zusätzlich zu RNAi haben wir bereits über einen erfolgreichen CRISPR/Cas9-vermittelten Genknockout in T. domestica8berichtet. Das CRISPR/Cas-System wurde häufig für die Genombearbeitung bei Insekten eingesetzt, insbesondere für gezielte Genknockouts. Seine Verwendung könnte für andere Anwendungen wie Genreporter-Assay, Zelllinienverfolgung und Manipulation der Transkriptionsaktivität erweitert werden, indem exogene Konstrukte nach der Einrichtung eines Protokolls zur Bereitstellung von Komponenten des CRISPR/Cas-Systems in Kerne9eingeschlagen werden. In Kombination mit der veröffentlichten Genombaugruppe10würde die breite Nutzung und Weiterentwicklung der CRISPR/Cas-basierten Genombearbeitung in T. domestica Studien erleichtern, die sich auf die evolutionären Mechanismen hinter dem herausragenden adaptiven Erfolg von Insekten konzentrieren. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Embryo-Mikroinjektion und für die Paarung von Adult T. domestica, um einen mutierten Stamm mit CRISPR/Cas9 zu erzeugen. Unter Berücksichtigung dieser neuartigen Methode diskutieren wir, wie wichtig es ist, die einzigartige Biologie nicht-traditioneller Modellarten für erfolgreiche Anwendungen dieser Techniken zu berücksichtigen.
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Protocol
1. Pflege von Laborkolonien
- Für die Erhaltung von Wildtyp- und Mutantenpopulationen verwenden Sie einen großen Kunststoffbehälter (460 mm x 360 mm x 170 mm) mit regelmäßiger künstlicher Fischnahrung, Wasser in Plastikbechern mit einem Lüftungsloch auf der Oberseite, ein gefaltetes Papier zum Verstecken der Insekten und geschichtete Baumwolle zum Eierlegen(Abbildung 2A). Halten Sie alle T. domestica Kulturen in 37 °C Inkubatoren und stellen Sie die relative Luftfeuchtigkeit (RH) in jedem Behälter auf 60%–80%.
HINWEIS: Da T. domestica Wasserdampf aus der Atmosphäre11absorbiert, ist eine direkte Wasserversorgung nicht erforderlich. Der entsprechende RH wird durch das Vorhandensein von Wasserdampf aus Kunststoffbechern, die ein Lüftungsloch auf der Oberseite oder von lidlosen Bechern in jedem Behälter enthalten, aufrechterhalten. Es besteht keine Notwendigkeit, in einem ganzen Brutkasten zu befeuchten, der Kulturen enthält. Die ungefähre Dauer jeder Entwicklungsphase unter der in diesem Protokoll beschriebenen Bedingung ist in Abbildung 1dargestellt. Die Entwicklungsgeschwindigkeit könnte durch Änderung der Temperatur und/oder RH12eingestellt werden. - Fügen Sie Regelmäßig Lebensmittel hinzu. Fügen Sie Wasser hinzu, bevor es austrocknet.
- Übertragen Sie die Populationen mindestens alle drei Monate in einen neuen sauberen Behälter, da Erwachsene aufhören, Eier in einer schmutzigen Umgebung und/oder einer dichten Bevölkerung zu legen (siehe Diskussion).
2. Eiersammlung und Mikroinjektion
- Entwerfen einer Führungs-RNA (gRNA)
- Entwerfen Sie eine gRNA-Sequenz für jedes benötigte Ziel und BLAST die gRNA-Sequenzen gegen die Genombaugruppe, um mögliche Off-Target-Erkennungsstellen zu überprüfen.
- Synthesisieren und reinigen Sie die gRNAs gemäß den Anweisungen des Herstellers8.
HINWEIS: Im Falle eines Targetings des weißen AtP-bindenden Kassettentransporters wurde beispielsweise eine Zielsequenz von 20 bp entwickelt und zwei synthetisierte DNA-Oligonukleotide 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTGTGTGGGAC-3' und 5'-TTCTAGCTCTAAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3' bestellt. Die DNA-Vorlage wurde durch Glühen dieser beiden Oligonukleotide, gefolgt von PCR-Amplifikation, hergestellt und die gRNA wird dann in vitro aus der Schablone mit einer T7-RNA-Polymerase transkribiert.
- Vorbereiten von Eiersammelkolonien
- Überführen Sie etwa 20 männliche und 20 weibliche Erwachsene in einen mittelgroßen Behälter (200 mm x 150 mm x 90 mm) mit Nahrung, Wasserversorgung, gefaltetem Papier und einem kleinen Stück geschichteter Baumwolle für die Eiablage(Abbildung 2B).
- Richten Sie mehrere Kolonien ein, um eine große Anzahl von inszenierten Embryonen in kurzer Zeit zu erhalten, um für die Genombearbeitung verwendet zu werden.
HINWEIS: Es wird erwartet, dass nach 8 h bei 37 °C etwa 20 bis 40 Eier aus einer Kolonie gesammelt werden. Es dauert in der Regel ein paar Tage für übertragene Erwachsene, um Eier zu legen, möglicherweise aufgrund der Anpassung an eine neue Umgebung.
- Ersetzen Sie am Tag der Injektion die Baumwolle in den Behältern durch neue.
- Legen Sie ein 76 mm x 5 mm doppelseitiges Klebeband auf einen normalen 76 mm x 26 mm Glasschlitten.
- Acht Stunden später sammeln Sie die Eier aus der geschichteten Baumwolle, indem Sie die Schichten mit Zangen trennen.
- Richten Sie die Eier auf dem doppelseitigen Klebeband mit einem nassen Pinsel aus und halten Sie einen Abstand von 2 mm zwischen den Eiern. Alle Eier sollten so ausgerichtet sein, dass die Längsachse eines Eis der Injektionsseite gegenübersteht (Abbildung 3A). Drücken Sie die Eier vorsichtig mit einem Pinsel für festes Halten während der Injektion.
HINWEIS: In diesem Protokoll wächst Pilz schnell in beschädigten injizierten Eiern unter nassem und warmem Zustand. Es ist wichtig, den Abstand zwischen den Eiern zu halten, um Kreuzkontamination und Ausdehnung des Pilzes zu verhindern. - Mischen Sie das gRNA- und Cas9-Protein auf eine Endkonzentration von 100 ng/l bzw. 500 ng/l. Verwenden Sie destilliertes Wasser zur Verdünnung. Inkubieren Sie die Mischung für 10 min bei Raumtemperatur, um Ribonukleoprotein-Komplexbildung zu fördern und dann die Mischung auf Eis zu halten.
HINWEIS: Neutrales Rot in einer Endkonzentration von 1% könnte der Injektionslösung hinzugefügt werden, um die injizierte Menge zu überwachen. - Mit einem Mikrolader 2 l der gRNA/Cas9-Lösung in eine Glasinjektionskapillare einzuladen. Stellen Sie sicher, dass sich vor der Injektion keine Luftblasen in der Lösung befinden. Tippen Sie bei Bedarf auf die Nadel, um die Blasen zu entfernen.
HINWEIS: In diesem Experiment wird eine fertige Nadel verwendet, um eine feine Nadelspitze zu erhalten (Abbildung 3B). Stattdessen könnte eine selbstgemachte Nadel mit ähnlicher Form verwendet werden. - Befestigen Sie die Glasinjektionskapillare, die zuvor mit der gRNA/Cas9-Lösung beladen war, an einem mit einem Manipulator ausgestatteten Halter fest und schließen Sie den Halter an einen elektronischen Mikroinjektor an.
- Optimieren Sie die Form der Nadelspitze, indem Sie sie leicht mit Zangen brechen, um Verstopfung zu verhindern und eine bessere Haltbarkeit während einer Reihe von Injektionen zu erhalten (ein Beispiel für eine geeignete Nadel ist in Abbildung 3Cdargestellt).
HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Nadel zu wechseln, wenn sie verstopft ist. Es ist möglich, weiterhin mit der gleichen Nadel zu injizieren, wenn es wieder mit Zange gebrochen wird, aber eine breitere Spitze führt zu mehr Eischaden und senkt ihre Überlebensrate. Da T. domestica Eier weich und zerbrechlich sind, ist das Halten einer feinen Nadelspitze der Schlüssel für eine hohe Überlebensrate nach der Injektion. - Setzen Sie die Nadel an der Mitte der Längsachse eines Eis ein und injizieren Sie eine leichte Menge der Lösung (siehe Abbildung 3D-H zur Angabe der Injektionsmenge). Passen Sie die Konfiguration des elektronischen Mikroinjektors während der Injektion an, abhängig von der Form der Nadelspitze.
HINWEIS: Es wird empfohlen, während der Injektion einen konstanten Druck aufzutragen, da sonst klebrige Eiinhalte leicht in die Glasnadel fließen und sie verstopfen können. Die Lösung kann sein, entweder mit einem kurzen Druckimpuls oder mit einem konstanten Druck zu injizieren, abhängig von der Menge der injizierten Flüssigkeit. Denken Sie daran, dass, wenn eine Nadelspitze eine breite Öffnung hat, zu viel Lösung in ein Ei injiziert wird, was tödlich enden(Abbildung 3F-H). In diesem Fall einen konstanten Flüssigkeitsfluss durch konstanten Druck aufrecht erhalten, dann die Nadel in ein Ei einsetzen und sofort herausziehen. Wenn es zu viel Überlauf verursacht oder das Ei platzt, ändern Sie die Nadel. - Bewahren Sie die injizierten Eier in einem Behälter mit der entsprechenden Größe für die Anzahl der injizierten Eier (<20 Eier: kleine Schale; >20 Eier: mittelgroße Behälter) mit 60%–80% RH und 37 °C auf.
3. Paarung
- Überprüfen Sie die injizierten Eier regelmäßig und entsorgen Sie beschädigte Eier mit Zangen, um Pilzwachstum zu vermeiden (Abbildung 3I,J). Falls zu viel Pilz auf einem Ei wächst, reinigen Sie die Oberfläche des Eis mit 70% EtOH.
- Vor dem Schlüpfen (ca. 10 Tage bei 37 °C nach Eiablage) die Glasrutsche mit den injizierten Eiern in Talkumpulver tauchen, um die Oberfläche des doppelseitigen Bandes zu beschichten. Dies wird das Stapeln von geschlüpften Nymphen vermeiden. Übertragen Sie die pulverbeschichteten Glasrutschen in einen mittelgroßen Behälter mit Nahrung, Wasser und einem gefalteten Papier zum Verstecken der Insekten.
- Entfernen Sie die Glasgleitet, nachdem die Nymphen geschlüpft sind. Liefern Sie regelmäßig Nahrung, bis sie das Erwachsenenalter erreichen.
HINWEIS: Es dauert etwa 2,0–2,5 Monate, bis Personen nach dem Schlüpfen das Erwachsenenalter erreichen (Abbildung 1A). Die Erwachsenenstufe wird anhand eines gut entwickelten Eileiters bei Frauen beurteilt (Abbildung 1B). - Um die Individuen zu paaren, übertragen Sie so viele wie nötig wilde weibliche Erwachsene aus einer Laborkolonie in den mittelgroßen Behälter und bebrüten sie für mindestens 14 Tage bei 37 °C, um sicherzustellen, dass sie jungfräulich sind.
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, jungfräuliche Weibchen aus einer Laborkolonie zu sammeln, weil erwachsene T. domestica einen wiederholten Zyklus von Molting und Paarung namens "Reproduktiv- und Molting-Zyklus", während der Weibchen werfen Weg Sperma mit jedem Molt und mate wieder in den nächsten Befruchtungszyklus13. - Übertragen Sie entweder einen männlichen oder einen weiblichen G0-Erwachsenen, der sich aus einem injizierten Ei und Wildtyp-Erwachsenen entwickelt hat, auf eine kleine Plastikschale (ca. 100 mm x 40 mm) mit Nahrung, einem gefalteten Papier und einem kleinen Stück Baumwolle zum Legen von G1-Eiern(Abbildung 2C'; Paarungsschale). Bewahren Sie die Paarungsgerichte in einem größeren Behälter mit 60%–80% RH auf (Abbildung 2C).
HINWEIS: Mehrere Wildtyp-Erwachsene können in ein Gericht aufgenommen werden, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Paarung zu erhöhen, obwohl hohe Erfolgsraten mit eins-zu-eins-Paarung erreicht wurden.
4. Genotypisierung
- Entwerfen Sie PCR-Primerpaare für jede gRNA, um ein 100–200 bp Produkt zu verstärken, das die von der gRNA angestrebte Site enthält. BLAST jede Primersequenz gegen die Genombaugruppe, um ihre Spezifität zu überprüfen (ein Beispiel für die Ausrichtung des weißen Gens in Abbildung 4A).
- Überprüfen Sie die Keimbahntransformation von G0-Erwachsenen.
- Fünf Tage nach dem Legen der Eier einzelne G1-Eier von jedem G0-Erwachsenenpaar in 0,2 ml-Röhrchen (ein Ei pro Tube; gesammelte Proben bei -20 °C für eine Langzeitlagerung lagern). Trennen Sie die Baumwollschichten, um die Eier zu sammeln.
HINWEIS: Es wird empfohlen, mindestens 12 G1-Nymphen aus jedem Paar zu genotypisieren, um den Erfolg der Keimbahnübertragung zu bewerten (siehe Repräsentative Ergebnisse). - Fügen Sie jeder Tube 15 l einer 0,25 mg/ml Proteinase-K-Lösung (gelöst in Tris-EDTA-Puffer) hinzu, homogenisieren Sie Proben kurz mit Zahnstochern und inkubieren Sie bei 55 °C für 3 bis 16 h.
- Inaktivieren Sie die Proteinase K, indem Sie die Proben 10 min bei 95 °C platzieren.
- Fügen Sie 90 l destilliertes Wasser in jedes Rohr und mischen Sie gut. Verwenden Sie 2 l Überstand in einem 10-L-PCR-Reaktionsmix, der die in Schritt 4.1 entworfenen Primer enthält.
HINWEIS: Die Verwendung einer DNA-Polymerase, die für rohe Schablonen optimiert ist, wird empfohlen, um eine ausreichende PCR-Verstärkung zu erreichen. - Um die PCR-Produkte zu analysieren, führen Sie einen Heteroduplex Mobility Assay (HMA) mit einem Mikrochip-Elektrophorese-System durch (Abbildung 3B; siehe Ohde et al., 2018)8.
ANMERKUNG: Mutationen könnten mit zwei alternativen Methoden bewertet werden: (1) HMA mit Standard-Gelpolymeren, wie z. B. 8% Polyacrylamid14; (2) Vergärung von PCR-Produkten mit T7-Endonuklease, gefolgt von Agarose-Gel-Elektrophorese15. - Bewahren Sie nur die G1-Nymphen auf, die von G0-Erwachsenen stammen, die Mutationen in ihrer Keimbahn enthalten, und entsorgen Sie die anderen.
- Fünf Tage nach dem Legen der Eier einzelne G1-Eier von jedem G0-Erwachsenenpaar in 0,2 ml-Röhrchen (ein Ei pro Tube; gesammelte Proben bei -20 °C für eine Langzeitlagerung lagern). Trennen Sie die Baumwollschichten, um die Eier zu sammeln.
- Individuelle Genotypisierung von G1-Nymphen/Erwachsenen
- Isolieren Sie G1-Nymphen in 24-Well-Platten mit einem Aspirator oder einem Pinsel. Legen Sie die 24-Well-Platten in einen größeren Behälter (z. B. den in diesem Protokoll verwendeten mittelgroßen Behälter) mit Wasserversorgung, wie oben beschrieben, um einen RH von 60 % bis 80 % zu halten(Abbildung 1D). Die Versorgung mit künstlichen regelmäßigen Fischfuttern aufrechtzuerhalten(Abbildung 1D').
HINWEIS: Obwohl dieser Schritt an jedem Punkt der Nymphen- und Erwachsenenstadien durchgeführt werden kann, wird empfohlen, ihn nach Erreichen des Erwachsenenalters und kurz vor der Paarung durchzuführen (>2,5 Monate nach der Injektion; Abbildung 1B) weil es einfacher ist, Feuerratten in einem großen Behälter zu warten. Die individuelle Aufzucht ist erforderlich, um den Genotyp jeder G1-Nymphe auf den folgenden Schritten zu verfolgen. G1 Nymphen aus dem gleichen G0-Erwachsenen können unterschiedliche Mutationen haben. - Cerci und das kaudale Filament einer Nymphe/Erwachsenen mit Zangen kneifen und ziehen und in ein 0,2 ml-Rohr mit 50 L EtOH einsammeln (die gesammelten Proben bei -20 °C für eine Langzeitlagerung lagern).
HINWEIS: Gewebeproben werden in EtOH gesammelt, da es den Verlust dieser kleinen Proben durch statische Elektrizität verhindert. Wenn man die Bewegung von Insekten stoppen muss, befeuchten Nymphe/Erwachsener auf Eis, wenn man Gewebeproben nimmt. Da T. domestica nach einer langzeitigen Abkühlung auf Eis nicht überleben kann, befeuchten Sie sie nicht länger als eine Minute und bringen Sie sie sofort wieder auf Raumtemperatur. Die Ablation von Cerci und dem kaudalen Filament führt nicht zu einer Erhöhung der Sterblichkeit. - Probenrohre mit geöffneten Deckeln auf einem Thermoblock 15 min bei 70 °C aufstellen, um den EtOH zu verdampfen.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.2.2–4.2.5 für die Genotypisierung.
- Übermitteln Sie die PCR-Produkte, bei denen ein mutiertes Bandmuster beobachtet wird, an einen Standardmäßigen Sanger-Sequenzierungsdienst.
- Halten Sie die G1 Nymphen/Erwachsenen mit den gewünschten Mutationen und verwerfen Sie die anderen (siehe Abbildung 4C für ein repräsentatives Sequenzierungsergebnis).
- Isolieren Sie G1-Nymphen in 24-Well-Platten mit einem Aspirator oder einem Pinsel. Legen Sie die 24-Well-Platten in einen größeren Behälter (z. B. den in diesem Protokoll verwendeten mittelgroßen Behälter) mit Wasserversorgung, wie oben beschrieben, um einen RH von 60 % bis 80 % zu halten(Abbildung 1D). Die Versorgung mit künstlichen regelmäßigen Fischfuttern aufrechtzuerhalten(Abbildung 1D').
- Überqueren Sie die Erwachsenen, die die gewünschten Mutationen in einer Paarungsschale enthalten, und erhalten Sie die nächsten Generationen, um einen homozygoten mutierten Stamm zu etablieren.
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Representative Results
In unseren Händen können etwa 100 Eier gut mit einer einzigen Injektionskapillare injiziert werden, wenn sie die entsprechende Spitze hat (Abbildung 3C). Die Injektion des gRNA/Cas9-Ribonukleoprotein-Komplexes in Embryonen innerhalb der ersten 8 h nach Eiablage führt zu Indels an der gRNA-Zielstelle. Dies führt dazu, dass biallelic Mutationen in einigen Zellen der injizierten Generation (G0) und damit mutierte Mosaik-Phänotypen werden in der Regel in G0 erhalten. Wenn dieses Protokoll beispielsweise verwendet wurde, um eine gRNA zu injizieren, die auf das weiße Gen abzielt, zeigen 32,6 % der G0-Nymphen einen teilweisen Pigmentverlust in ihren zusammengesetzten Augen und dorsalen Regionen (Abbildung 5)8.
Mit der derzeit beschriebenen Trockeninjektionsmethode, wenn 80-120 Eier injiziert werden, beträgt die Überlebensrate der injizierten Embryonen bis zu 40%–60%. Dies steht im Gegensatz zur vorherigen Nassinjektionsmethode, bei der Eier auf einer Agaroseplatte injiziert und gepflegt werden, was gelegentlich zu einer Überlebensrate von weniger als 10% führt.
Die Bewertung der Keimbahntransformation von G0-Erwachsenen und mutierten G1-Personen erfolgte durch genomische PCR, gefolgt von HMA. In HMA, Wildtyp und mutierten Allele anneal in jeder möglichen Kombination, die in der Regel führt in vier unterschiedlichen Bändern auf einem Gel Elektrophorese (zwei Homoduplexe und zwei Heteroduplexe)14. In G1-Samples sind Differentialbandmuster zwischen Wildtyp und mutierten Samples deutlich unterscheidbar (Abbildung 4B). Die Keimbahntransformation wurde bei 39,1% der G0-Erwachsenen gefunden, als wir das weiße Gen8ins Visier nahmen. Nach unserer Erfahrung schwankt der Anteil der mutierten Individuen in G1-Nymphen von einem einzigen G0-Paar zwischen 25% und 100%.
Um die Auswirkungen unserer Paarungsumgebung auf den Paarungserfolg zu bewerten, kreuzten wir Wildtyp-Erwachsene in einer Paarungsschale und erzielten eine Erfolgsquote von 95,8% (23/24 Paare).
Abbildung 1: Der Lebenszyklus von T. domestica. (A) Ungefähre Dauer jeder Entwicklungsstufe in T. domestica. (B) Dorsale Ansicht eines erwachsenen Weibchens. Pfeilspitze zeigt einen gut entwickelten Ovipositor an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Künstliche Umgebungen, die in diesem Protokoll verwendet werden. (A) Ein großer Behälter für Laborkolonie, (B) ein mittelgroßer Behälter für die Eiersammlung, (C) Paarungsgeschirr mit Wasserversorgung in einem großen Behälter, (C') eine Steckschale, (D) eine 24-Well-Platte mit Wasserversorgung im mittelgroßen Behälter. Boxed Region wird vergrößert in (D') um eine T. domestica Individuum zu zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Trockene Injektion von T. domestica Eiern. (A) Eier, die auf einer Glasrutsche ausgerichtet sind. Schwarzer Pfeil zeigt den Punkt an, an dem eine Nadel eingesetzt wird. (B) Form einer zur Injektion verwendeten Glasnadelspitze. (C) Die gleiche Glasnadel vor (oben) und nach (unten) brechen die Spitze. Die Nadeln wurden mit 1% neutralem Rot gefüllt. Pfeilspitze zeigt die Spitze der Nadel. Maßstab senist 1 mm. (D) Nicht injiziertes Ei. (E) Ein gutes Beispiel für eine Injektion. Pfeil zeigt den Injektionspunkt an. (F-H) Die Lösung ist von der injizierten Stelle (F) oder von der gegenüberliegenden Seite (G) des injizierten Eis überlaufen; zu viel Injektionsvolumen verursachte einen Burst (H). Pfeilspitze zeigt übergelaufenen Eiinhalt an. (I) Normalerweise entwickelt späten Embryo. Pfeilspitze zeigt das farbige zusammengesetzte Auge an. (J) Geschrumpftes eidesbeschädigtes Ei 3 Tage nach der Injektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Genotypisierung von G1-Personen. (A) PCR-Primer wurden entwickelt, um eine genomische Region von 120 bp zu verstärken, die die gRNA-Zielstelle enthält. (B) Mehrere Bänder von Homoduplex- und Heteroduplex-DNAs werden in mutierten Samples nachgewiesen, während einzelne Bänder in nicht mutierten Samples auftreten. L: DNA-Leiter, U: unmutierte Proben, M: mutierte Proben. (C) Repräsentatives Ergebnis der direkten Sequenzierung von PCR-Produkten aus Wildtyp- und heterozygoten mutierten Proben. Sequenzen von Wildtyp und Mutant ( 
) Allel werden oben gezeigt. Die in (A) dargestellte Vorwärtsgrundierung wurde als Sequenzierungsgrundierung verwendet. Die Sequenz einer heterozygoten Mutante (unten) wird durch zwei überlappende Sequenzen von der vorhergesagten Spaltungsstelle (Pfeil) angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Mosaikverlust von Pigmentierungen in zusammengesetzten Augen und in der rückenden Region nach der Ausrichtung auf das weiße Gen mit gRNA/Cas9-Proteininjektion. (A) Wildtyp und (B) weiße gRNA/Cas9-Protein-injizierte erste Instar Nymphen. Teilweiser Verlust von schwarzen und rosa Pigmentierungen in den Augen (Pfeilspitze) und im Rückenbereich (Pfeil) sind angezeigt. Die Maßstabsleiste ist 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Für die erfolgreiche Erzeugung der gewünschten T. domestica Mutante mit CRISPR/Cas9 ist es zunächst wichtig, eine ausreichende Anzahl von inszenierten Embryonen zur Injektion zu sammeln. Für eine konstante Sammlung einer ausreichenden Anzahl von T. domestica Eiern ist der Schlüssel, eine geeignete Größe des Behälters zu wählen, um eine geringere Bevölkerungsdichte zu haben, da es zum erfolgreichen Abschluss einer Reihe von komplexen Paarungsverhalten beitragen würde, die nach jedem Erwachsenenmolt13wiederholt wird. Ein männlicher T. domestica Erwachsener überträgt sein Sperma indirekt über ein Spermatophore an ein Weibchen. Sweetman (1938) berichtete, dass es männliche Erwachsene 20 bis 35 min von der Einleitung des Paarungsverhaltens bis zur Platzierung eines Spermatophores12dauert. Es ist wahrscheinlich, dass eine Störung der Interaktion zwischen einem Paar durch andere Personen eine erfolgreiche Befruchtung verhindert, die häufiger in einer dichten Umgebung auftreten könnte.
Obwohl Eier 8 h gesammelt werden, nachdem die Baumwolle in einem Behälter ersetzt wurde, um genügend Eier in unserem Protokoll zu sammeln, kann die höhere Effizienz der Genombearbeitung erreicht werden, indem Eier gesammelt und innerhalb einer kürzeren Zeit (z. B. 4 h nach der Eiablage) injiziert werden, wenn injizierte Materialien mehr Chancen haben, an den großen Teil der Kerne geliefert zu werden. Die Injektion in eine ausreichende Anzahl von Eiern innerhalb einer kürzeren Zeit könnte erfolgen, indem (1) die Anzahl oder Größe der Behälter erhöht wird, wenn der Platz es zulässt, oder (2) das gleiche Verfahren wiederholen, um eine ausreichende Anzahl von injizierten Eiern zu erhalten.
Die Injektionsstelle wird allgemein als wichtig für die erfolgreiche Keimbahntransformation bei Insekten angesehen. T. domestica Eier sind in der Regel ellipsoid in Form und enthalten ein Keimband an einem Pol ihrer Längsachse. Es wird empfohlen, die gRNA/Cas9-Mischung in der Mitte der Längsachse des Eis zu injizieren, da es aufgrund der variablen Form von T. domestica Ei schwierig ist, den Pol zu identifizieren, an dem sich in frühen Embryonen ein Keimband bildet. Obwohl die gRNA/Cas9-Lösung nicht direkt an die Stelle der Keimbandbildung injiziert wird, haben wir eine Keimbahntransformation bei bis zu 39,1% der G0-Erwachsenen8erreicht.
Während der Mikroinjektion von Eiern ist es wichtig, eine feine Nadelspitze zu verwenden, um eine hohe Überlebensrate zu erhalten, wie es bei anderen Tiermodellen der Fall ist. Wir haben nach der Injektion mit fertigen Nadeln eine höhere Überlebensrate erhalten als bei der Verwendung von hausgemachten Glasnadeln in T. domestica Eiern. Eine ähnlich hohe Überlebensrate könnte jedoch durch Diereplikation der feinen Nadelform mit selbstgemachten Nadeln erreicht werden (siehe Abbildung 3B,C). Nach unserer Erfahrung führt die Trockeninjektionsmethode zu einer höheren Überlebensrate als die zuvor gemeldeteNassinjektionsmethode 8. Wir fanden heraus, dass die Inkubation von Eiern in einer trockenen Umgebung der Schlüssel für diese Verbesserung ist, wobei wir die Tatsache ausnutzen, dass T. domestica Eier und frühe Nymphen resistent gegen Austrocknung sind. Dies entspricht früheren Berichten, die darauf hindeuten, dass diese Art eine trockene Umgebung vorallem in frühen Entwicklungsstadien bevorzugt und dass eine feuchte Umgebung sogar schädlich sein kann16. Anstelle einer Plastikplatte kann ein Agarosegel für eine schnelle Ausrichtung der Eier verwendet werden; Die Übertragung der injizierten Eier auf eine trockene Oberfläche führt jedoch zu einer höheren Überlebensrate.
Abschließend unterstreicht unsere Methode, wie wichtig es ist, die einzigartige Biologie von T. domestica für eine erfolgreiche Genombearbeitung zu berücksichtigen: eine dünne Umgebung für das Sammeln einer ausreichenden Anzahl von Eiern und eine trockene Umgebung für eine höhere Überlebensrate von injizierten Embryonen zu erhalten. Die hier berichteten grundlegenden Protokolle für Injektion, Paarung und Kulturerhaltung werden nicht nur zur Erzeugung mutierter Stämme mit Genombearbeitung verwendet, sondern auch für Anwendungen anderer genetischer Werkzeuge wie RNAi und Transgenese und werden dazu beitragen, die Mechanismen zu verstehen, die der frühen Evolution von Insekten zugrunde liegen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
TO und TD wurden von den JSPS KAKENHI-Zuschussnummern 19H02970 bzw. 20H02999 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
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