Summary
Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för uppfödning, mikroinjektion av ägg och för effektiv parning av eldbromsen Thermobia domestica för att generera och upprätthålla mutantstammar efter genomredigering.
Abstract
Firebrat Thermobia domestica är en ametabolisk, vinglös art som är lämplig för att studera utvecklingsmekanismerna hos insekter som ledde till deras framgångsrika evolutionära strålning på jorden. Tillämpningen av genetiska verktyg som genomredigering är nyckeln till att förstå genetiska förändringar som är ansvariga för evolutionära övergångar i en Evo-Devo-strategi. I den här artikeln beskriver vi vårt nuvarande protokoll för att generera och upprätthålla mutanta stammar av T. domestica. Vi rapporterar en torr injektionsmetod, som ett alternativ till den rapporterade våtinjektionsmetoden, som gör att vi kan få stabilt höga överlevnadshastigheter i injicerade embryon. Vi rapporterar också en optimerad miljöinställning för att para vuxna och få efterföljande generationer med hög effektivitet. Vår metod understryker vikten av att ta hänsyn till varje arts unika biologi för en framgångsrik tillämpning av genomredigeringsmetoder på icke-traditionella modellorganismer. Vi förutspår att dessa genomredigeringsprotokoll kommer att bidra till att implementera T. domestica som laboratoriemodell och att ytterligare påskynda utvecklingen och tillämpningen av användbara genetiska verktyg i denna art.
Introduction
Thermobia domestica tillhör en av de mest basala insektsbeställningarna, Zygentoma, som behåller en förfädernas ametabola och vinglösa livscykel. Sådana basala fylogenetiska positioner och förfäders egenskaper sätter denna art som en attraktiv modell för att studera mekanismerna bakom framgången för insekter på jorden, som täcker över 70% av de beskrivnadjurarterna 1. T. domestica har länge främst använts för att studera insektsfysiologins förfäders egenskaper på grund av dess lämpliga egenskaper som laboratoriemodell, såsom en relativt kort livscykel (2,5–3,0 månader från embryo till reproduktiv vuxen; Figur 1A) och en enkel avel. Under de senaste tre decennierna har dess användning utvidgats för att undersöka förfädernas egenskaper hos olika egenskaper som kroppsplan, neural differentiering och dygnsrytmer2,3,4.
Tillämpningen av avancerade genetiska verktyg i T. domestica skulle ytterligare kunna påskynda sådana bidrag inom ett brett forskningsområde. Framgångsrik RNA-interferens (RNAi)-medierad gen knockdown i embryon, nymfer och vuxna har rapporterats i T. domestica4,5,6. Effektiviteten hos systemisk RNAi är fortfarande mycket artberoende - till exempel är den i allmänhet hög i coleoptera medan den är låg i lepidoptera-ordningen7. Effektiviteten och varaktigheten av RNAi-knockdownen i T. domestica har ännu inte utvärderats. Förutom RNAi har vi tidigare rapporterat en framgångsrik CRISPR / Cas9-medierad gen knockout i T. domestica8. CRISPR/Cas-systemet har tillämpats i stor utsträckning för genomredigering i insekter, särskilt för riktad gen knockout. Dess användning kan utökas för andra tillämpningar såsom genreporteranalys, cell härstamning spårning och manipulering av transkriptionell aktivitet genom att knacka in exogena konstruktioner efter upprättandet av ett protokoll för att leverera komponenter i CRISPR / Cas-systemet i atomkärnor9. I kombination med den publiceradegenommonteringen 10skulle den breda användningen och vidareutvecklingen av CRISPR/Cas-baserad genomredigering i T. domestica underlätta studier med fokus på de evolutionära mekanismerna bakom insekternas enastående adaptiva framgång. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för embryomikroinjektion och för parning av vuxen T. domestica för att generera en mutant stam med CRISPR/ Cas9. Med tanke på denna nya metod diskuterar vi vikten av att överväga den unika biologin hos icke-traditionella modellarter för framgångsrika tillämpningar av dessa tekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Underhåll av laboratoriekolonier
- För underhåll av vilda och muterade populationer, använd en stor plastbehållare (460 mm x 360 mm x 170 mm) med vanlig konstgjord fiskmat, vatten i plastkoppar med ett ventilationshål på toppen, ett vikt papper för att dölja insekterna och skiktad bomull för att lägga ägg (Figur 2A). Håll alla T. domestica kulturer inuti 37 °C inkubatorer och ställ in den relativa luftfuktigheten (RH) inuti varje behållare till 60%-80%.
OBS: Eftersom T. domestica absorberar vattenånga från atmosfären11behövs ingen direkt vattenförsörjning. Lämplig RH upprätthålls på grund av närvaron av vattenånga från plastkoppar som innehåller ett ventilationshål på toppen eller från lockfria koppar inuti varje behållare. Det finns inget behov av att fukta inuti en hel inkubator som innehåller kulturer. Den ungefärliga varaktigheten för varje utvecklingsstadium under det villkor som beskrivs i detta protokoll visas i figur 1. Utvecklingshastigheten kan justeras genom att ändra temperaturen och/eller RH12. - Tillsätt mat regelbundet. Tillsätt vatten innan det torkar upp.
- Överför populationerna till en ny ren behållare minst var tredje månad med tanke på att vuxna slutar lägga ägg i en smutsig miljö och/eller tät befolkning (se Diskussion).
2. Äggsamling och mikroinjektion
- Designa en guide RNA (gRNA)
- Designa en gRNA-sekvens för varje nödvändigt mål och SPRÄNG gRNA-sekvenserna mot genomenheten för att kontrollera möjliga platser för igenkänning utanför målet.
- Syntetisera och rena gRNAs enligt tillverkarens instruktioner8.
OBS: Som ett exempel, när det gäller att rikta in sig på ATP-bindande kassetttransportören vit gen, konstruerades en 20 bp målsekvens och två syntetiserade DNA-oligonukleotider 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' och 5'-TTCTAGCTCTAAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3' beställdes. DNA mallen utarbetades genom glödgning dessa två oligonucleotides följt av PCR amplifiering och gRNA är sedan in vitro transkriberas från mallen med en T7 RNA polymeras.
- Förbered äggsamlingskolonier
- Överför cirka 20 vuxna män och 20 kvinnor till en medelstor behållare (200 mm x 150 mm x 90 mm) med mat, vattenförsörjning, ett vikt papper och en liten bit skiktad bomull för äggläggning (Figur 2B).
- Ställ in flera kolonier för att få ett stort antal iscensatta embryon på kort tid för att användas för genomredigering.
OBS: Cirka 20–40 ägg förväntas samlas in från en koloni efter 8 timmar vid 37 °C. Det tar vanligtvis några dagar för överförda vuxna att börja lägga ägg, eventuellt på grund av anpassning till en ny miljö.
- På injektionsdagen, byt ut bomullen inuti behållarna med nya.
- Placera en 76 mm x 5 mm dubbelsidig tejp på en vanlig 76 mm x 26 mm glasbild.
- Åtta timmar senare samlar du äggen från den skiktade bomullen genom att separera lagren med tång.
- Rikta äggen på den dubbelsidiga tejpen med en våt pensel och håll ett avstånd på 2 mm mellan äggen. Alla ägg ska vara orienterade så att ett äggs längsgående axel vetter mot injektionssidan (figur 3A). Tryck försiktigt ner äggen med en pensel för fast innehav under injektionen.
OBS: I detta protokoll växer svamp snabbt i skadade injicerade ägg under vått och varmt tillstånd. Det är viktigt att hålla avståndet mellan äggen för att förhindra korskontaminering och expansion av svamp. - Blanda gRNA- och Cas9-proteinet till en slutlig koncentration på 100 ng/μL respektive 500 ng/μL. Använd destillerat vatten för utspädning. Inkubera blandningen i 10 min vid rumstemperatur för att främja ribonukleoproteinkomplexbildning och håll sedan blandningen på is.
OBS: Neutralrött vid en slutlig koncentration på 1% kan tillsättas injektionslösningen för att övervaka den injicerade mängden. - Ladda 2 μL av gRNA/Cas9-lösningen i en glasinsprutnings kapillär med en mikrolastare. Se till att det inte finns några luftbubblor i lösningen före injektionen. Tryck vid behov på nålen för att ta bort bubblorna.
OBS: I detta experiment används en färdig nål för att få en fin nålspets (Figur 3B). En hemlagad nål med liknande form skulle kunna användas istället. - Fäst glasinsprutnings kapillären, som tidigare var laddad med gRNA/Cas9-lösningen, på en hållare utrustad med en manipulator och anslut hållaren till en elektronisk mikroinjektor.
- Optimera nålspetsens form genom att bryta den något med tång för att förhindra igensättning och bättre hållbarhet under en serie injektioner (ett exempel på en lämplig nål visas i figur 3C).
OBS: Det rekommenderas att byta en nål när den är igensatt. Det är möjligt att fortsätta injicera med samma nål om den bryts igen med tång, men en bredare spets leder till fler äggskador och sänker deras överlevnadsgrad. Eftersom T. domestica ägg är mjuka och bräckliga, hålla en fin nål spets är nyckeln till att ha en hög överlevnadsgrad efter injektion. - För in nålen mitt i ett äggs längsgående axel och injicera en liten mängd av lösningen (se figur 3D–H för referens på injektionsmängden). Justera konfigurationen av den elektroniska mikroinjektorn under injektionen, beroende på nålspetsens form.
OBS: Det rekommenderas att applicera ett konstant tryck under injektionen, annars kan klibbigt ägginnehåll lätt strömma in i glasnålen och kan täppa till den. Lösningen kan vara att antingen injicera med kort tryckpuls eller med ett konstant tryck, beroende på mängden vätska som injiceras. Tänk på att när en nålspets har en bred öppning injiceras för mycket lösning i ett ägg, vilket orsakar dödligheten (figur 3F-H). I så fall, behåll ett konstant vätskeflöde genom konstant tryck, sätt sedan in nålen i ett ägg och dra ut det omedelbart. Om det orsakar för mycket överflöd eller ägget spricker, byt nål. - Förvara de injicerade äggen i en behållare med lämplig storlek för antalet injicerade ägg (<20 ägg: liten maträtt; >20 ägg: medelstor behållare) med 60–80 % RH och 37 °C.
3. Parning
- Kontrollera de injicerade äggen regelbundet och kassera skadade ägg med tång för att undvika svamptillväxt (figur 3I,J). Om för mycket svamp växer på ett ägg, rengör äggets yta med 70% EtOH.
- Före kläckning (ca 10 dagar vid 37 °C efter äggläggning), doppa glasrutschbanan med de injicerade äggen i talkpulver för att täcka ytan på det dubbelsidiga tejpen. Detta kommer att undvika stapling av kläckta nymfer. Överför de pulverlackerade glasrutschbanorna till en medelstor behållare med mat, vatten och ett vikt papper för att dölja insekterna.
- Ta bort glasrutschbanorna efter att nymferna har kläckts. Leverera regelbundet mat tills de når vuxen ålder.
OBS: Det tar cirka 2,0–2,5 månader för individer att nå vuxen ålder efter att de kläckts (Figur 1A). Vuxenstadiet bedöms utifrån en välutvecklad ovipositor hos kvinnor (Figur 1B). - För att para individerna, överför så många som behövs vilda kvinnliga vuxna från en laboratoriekoloni till den medelstora behållaren och inkubera dem i minst 14 dagar vid 37 °C för att se till att de är jungfruliga.
OBS: Det är inte nödvändigt att samla jungfruliga honor från en laboratoriekoloni eftersom vuxna T. domestica har en upprepad cykel av smältning och parning som kallas "reproduktiv och smältcykel", under vilken kvinnor kastar bort spermier med varje molt och kompiserar igen i nästa befruktningscykel13. - Överför antingen en manlig eller en kvinnlig G0-vuxen som utvecklats från ett injicerat ägg och vilda vuxna till en liten plastform (Ø 100 mm x 40 mm) med mat, ett vikt papper och en liten bomullsbit för läggning av G1-ägg (figur 2C'; parningsfat). Förvara parningsfaten i en större behållare med 60–80 % RH(figur 2C).
OBS: Flera vilda vuxna kan inkluderas i en maträtt för att öka risken för framgångsrik parning, även om höga framgångsgrader har uppnåtts med en-till-en-parning.
4. Genotypning
- Designa PCR primer par för varje gRNA för att förstärka en 100-200 bp produkt som inkluderar platsen som är mål för gRNA. BLAST varje primersekvens mot genomenheten för att kontrollera dess specificitet (ett exempel visas för inriktning av den vita genen i figur 4A).
- Kontrollera bakterien omvandling av G0 vuxna.
- Fem dagar efter att äggen har lagts samlar du enskilda G1-ägg från varje G0-vuxenpar i 0,2 ml-rör (ett ägg per rör; förvarar insamlade prover vid -20 °C för långtidslagring). Separera bomullslagren för att samla äggen.
OBS: Det rekommenderas att genotyp minst 12 G1 nymfer från varje parningspar för att utvärdera framgången för könscellsöverföringen (se representativa resultat). - Tillsätt 15 μL av en 0,25 mg/ml Proteinas K-lösning (upplöst i Tris-EDTA-buffert) till varje rör, homogenisera kort proverna med tandpetare och inkubera vid 55 °C i 3 till 16 timmar.
- Inaktivera Proteinas K genom att placera proverna vid 95 °C i 10 min.
- Tillsätt 90 μL destillerat vatten till varje rör och blanda väl. Använd 2 μL supernatant i en 10 μL PCR-reaktionsblandning som innehåller primerna konstruerade i steg 4.1.
OBS: Användning av ett DNA-polymeras optimerat för råa mallar rekommenderas för att nå tillräckligt med PCR-förstärkning. - För att analysera PCR-produkterna, utför en heteroduplex mobilitetsanalys (HMA) med ett mikrochipelektroforessystem (Figur 3B; se Ohde et al., 2018)8.
OBS: Mutationer kan bedömas med två alternativa metoder: (1) HMA med standardgelpolymerer, såsom 8% polyakrylamid14; (2) Matsmältning av PCR-produkter med T7 endonukleas följt av agarose gel electrophoresis15. - Håll endast G1 nymfer som härrör från G0 vuxna som innehåller mutationer i deras könsceller och kassera de andra.
- Fem dagar efter att äggen har lagts samlar du enskilda G1-ägg från varje G0-vuxenpar i 0,2 ml-rör (ett ägg per rör; förvarar insamlade prover vid -20 °C för långtidslagring). Separera bomullslagren för att samla äggen.
- Individuell genotypning av G1 nymfer/vuxna
- Isolera G1 nymfer i 24-brunnsplattor med en aspirator eller en pensel. Placera 24-brunnsplattorna i en större behållare (t.ex. den medelstora behållaren som används i detta protokoll) med vattenförsörjning enligt beskrivningen ovan för att hålla en RH på 60–80 % (figur 1D). Upprätthålla tillgången på konstgjorda vanliga fiskfoder(figur 1D).
OBS: Även om detta steg kan utföras när som helst i nymfala och vuxna stadier, rekommenderas att utföra det efter att ha nått vuxen ålder och strax före parkoppling (>2,5 månader efter injektion; Figur 1B) eftersom det är lättare att underhålla eldbromsar i en stor behållare. Individuell uppfödning krävs för att spåra genotypen för varje G1-nymf på följande steg. G1 nymfer från samma G0 vuxna kan ha olika mutationer. - Nyp och dra cerci och den kaudala glödtråden från en nymf/vuxen med tång och samla dem i ett 0,2 ml-rör som innehåller 50 μL EtOH (förvara de insamlade proverna vid -20 °C för långtidslagring).
OBS: Vävnadsprover samlas in i EtOH eftersom det förhindrar förlust av dessa små prover på grund av statisk elektricitet. Om man behöver stoppa insektens rörelse, bedöva nymf / vuxen på is när man tar vävnadsprover. Eftersom T. domestica inte kan överleva efter långvarig kylning på is, bedöva dem inte i mer än en minut och flytta dem omedelbart tillbaka till rumstemperatur. Ablation av cerci och kaudal glödtråd orsakar ingen ökning av dödligheten. - Placera provrören med locken öppna på ett termiskt block i 15 min vid 70 °C för att avdunsta EtOH.
- Upprepa steg 4.2.2–4.2.5 för genotypning.
- Skicka in PCR-produkterna där ett mutantbandsmönster observeras till en standard sanger-sekvenseringstjänst.
- Håll G1 nymfer/vuxna med önskade mutationer och kassera de andra (se figur 4C för ett representativt sekvenseringsresultat).
- Isolera G1 nymfer i 24-brunnsplattor med en aspirator eller en pensel. Placera 24-brunnsplattorna i en större behållare (t.ex. den medelstora behållaren som används i detta protokoll) med vattenförsörjning enligt beskrivningen ovan för att hålla en RH på 60–80 % (figur 1D). Upprätthålla tillgången på konstgjorda vanliga fiskfoder(figur 1D).
- Korsa de vuxna som innehåller önskade mutationer i en parningsrätt och få nästa generation att etablera en homozygous mutant stam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I våra händer kan cirka 100 ägg injiceras väl med en enda injektion kapillär när den har tillräcklig spets (Figur 3C). Injektion av gRNA/Cas9 ribonukleoprotein komplex i embryon inom de första 8 h efter äggläggning resulterar i indels på gRNA riktade platsen. Detta orsakar biallelic mutationer i vissa celler i den injicerade generationen (G0) och därmed mutant mosaik fenotyper erhålls vanligtvis i G0. Till exempel, när detta protokoll användes för att injicera ett gRNA som är utformat för att rikta in sig på den vita genen, visar 32,6% av G0 nymfer partiell förlust av pigmentering i sina sammansatta ögon och dorsala regioner (Figur 5)8.
Med hjälp av den för närvarande beskrivna torrinjektionsmetoden, när 80–120 ägg injiceras, är överlevnadsgraden för de injicerade embryona så hög som 40–60 %. Detta står i kontrast till den tidigare våtinjektionsmetoden, där ägg injiceras och hålls på en agarosaplatta, vilket ibland resulterar i en överlevnadsgrad på mindre än 10%.
Bedömning av könsceller omvandling av G0 vuxna och muterade G1 individer gjordes av genomisk PCR följt av HMA. I HMA, wildtype och mutanta alleler glödgning i varje möjlig kombination, vilket vanligtvis resulterar i fyra distinkta band på en gel elektrofores (två homoduplexes och två heteroduplexes)14. I G1-prover är differentiella bandmönster mellan vilda och muterade prover tydligt urskiljbara(figur 4B). Germline omvandling hittades i 39,1% av G0 vuxna när vi riktade in oss på den vita genen 8. Enligt vår erfarenhet varierar andelen muterade individer i G1 nymfer från ett enda G0-par från 25% till 100%.
För att utvärdera effekten av vår parningsmiljö på parningsframgången korsade vi vilda vuxna i en parningsrätt och fick en framgångsgrad på 95,8% (23/24 par).
Figur 1: Livscykeln för T. domestica. a)Ungefärlig varaktighet för varje utvecklingsstadium i T. domestica. B)Dorsal syn på en vuxen kvinna. Arrowhead indikerar en välutvecklad ovipositor. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Konstgjorda miljöer som används i det här protokollet. A)En stor behållare för laboratoriekoloni,B)en medelstor behållare för ägguppsamling,C)parningsfat med vattenförsörjning i en stor behållare,(C') en parningsform,(D)en 24-brunnsplatta med vattenförsörjning i medelstor behållare. Boxad region förstoras i (D ') för att visa en T. domestica individ. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Torr injektion av T. domesticaägg. A)Ägg i linje med en glasrutschbana. Svart pil anger den punkt där en nål sätts in. B)Form på en glasnålspets som används för injektion. C)Samma glasnål innan (överkant) och efter (botten) bryta spetsen. Nålar fylldes med 1% neutral röd. Pilspetsen anger nålens spets. Skalstången är 1 mm. (D) Opin injicerat ägg. (E)Ett bra exempel på en injektion. Pilen anger injektionspunkten. (F–H) Lösningen svämmar över från det injicerade stället (F) eller från motsatt sida (G) av det injicerade ägget; för mycket injektionsvolym orsakade bristning (H). Pilspetsen anger överfull ägghalt. ( I) Normalt utvecklat sent embryo. Pilspetsen anger det färgade sammansatta ögat. (J) Krympt skadat ägg 3 dagar efter injektion. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Genotypning av G1-individer. (A) PCR-primers är utformade för att förstärka en 120 bp genomisk region som inkluderar gRNA-målplatsen. (B) Flera band av homoduplex- och heteroduplex-DNA upptäcks i muterade prover medan enstaka band förekommer i omuterade prover. L: DNA-stege, U: omuterade prover, M: muterade prover. C)Representativt resultat av direkt sekvensering av PCR-produkter från vilda och heterozygous mutantprover. Sekvenser av vildtyp och mutant 
( ) allel visas överst. Den främre primern som visas i (A) användes som en sekvensering primer. Sekvensen av en heterozygous mutant (botten) indikeras av två överlappande sekvenser från den förväntade klyvningsplatsen (pil). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Mosaikförlust av pigmenteringar i sammansatta ögon och i dorsala regionen efter att ha riktat in sig på den vita genen med gRNA/Cas9 proteininjektion. A)Vildtyp och (B) vit gRNA/Cas9 protein-injiceras första instar nymfer. Partiell förlust av svarta och rosa pigmenteringar i ögonen (pilspets) och i dorsala regionen (pil) anges. Skalbar är 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För den framgångsrika generationen av önskad T. domestica mutant med CRISPR/Cas9 är det först viktigt att samla in ett tillräckligt antal iscensatta embryon för injektion. För en konstant samling av ett tillräckligt antal T. domestica ägg är nyckeln att välja en lämplig storlek på behållaren för att ha en lägre befolkningstäthet eftersom det skulle hjälpa till att framgångsrikt slutföra en serie komplexa parningsbeteenden, som upprepas efter varje vuxen molt13. En manlig T. domestica vuxen överför sin spermier indirekt till en kvinna via en spermatofor. Sweetman (1938) rapporterade att det tar manliga vuxna 20 till 35 min från början av parningsbeteendet till placeringen av en spermatofor12. Det är troligt att störningar i interaktionen mellan ett parningspar av andra individer förhindrar framgångsrik befruktning, vilket kan hända oftare i en tät miljö.
Även om ägg samlas in 8 timmar efter att bomullen har bytts ut i en behållare för att samla tillräckligt med ägg i vårt protokoll, kan den högre effektiviteten av genomredigering uppnås genom att samla ägg och injicera dem inom en kortare tid (t.ex. 4 h efter äggläggning) när injicerade material har större chans att levereras till den stora andelen atomkärnor. Injektion till ett tillräckligt antal ägg inom en kortare tid kan göras genom att (1) öka antalet eller storleken på behållarna om utrymmet tillåter, eller (2) upprepa samma förfarande för att erhålla ett tillräckligt antal injicerade ägg.
Injektionsstället anses i allmänhet vara viktigt för framgångsrik bakterieomvandling hos insekter. T. domestica ägg är vanligtvis ellipsoidal i form och innehåller ett bakterieband vid en pol av deras längsgående axel. Det rekommenderas att injicera gRNA/ Cas9-blandningen vid mitten av äggets längsgående axel eftersom det är svårt att identifiera polen där ett bakterieband bildas i tidiga embryon på grund av den variabla formen av T. domestica ägg. Även om gRNA / Cas9-lösningen inte injiceras direkt till platsen för bakteriebandsbildningen, har vi uppnått bakterielinjetransformation i så hög som 39,1% av G0 vuxna8.
Under mikroinjektion av ägg är det viktigt att använda en fin nålspets för att få en hög överlevnadsgrad, som det är fallet för andra djurmodeller. Vi fick en högre överlevnadsgrad efter injektion med färdiga nålar än vid användning av hemlagade glasnålar i T. domestica ägg. En lika hög överlevnadsgrad skulle dock kunna uppnås genom att den fina nålformen replikeras med hemmagjorda nålar (som visas i figur 3B,C). Enligt vår erfarenhet resulterar torrinjektionsmetoden i en högre överlevnadsgrad än den tidigare rapporterade våtinjektionsmetoden8. Vi fann att ägginkubation i en torr miljö är nyckeln till denna förbättring, dra nytta av det faktum att T. domestica ägg och tidiga nymfer är resistenta mot uttorkning. Detta är i enlighet med tidigare rapporter som tyder på att denna art föredrar en torr miljö särskilt under tidiga utvecklingsstadier och att en våt miljö till och med kan vara skadlig16. Istället för en plastplatta kan en agarosegel användas för en snabb justering av äggen; Överföring av de injicerade äggen till en torr yta leder dock till en högre överlevnadsgrad.
Sammanfattningsvis understryker vår metod vikten av att ta hänsyn till T. domesticas unika biologi för en framgångsrik genomredigering: att hålla en gles miljö för att samla ett tillräckligt antal ägg och en torr miljö för att ha en högre överlevnadsgrad av injicerade embryon. De grundläggande protokollen för injektion, parning och odlingsunderhåll som rapporteras här används inte bara för att generera mutantstammar med genomredigering, men också för tillämpningar av andra genetiska verktyg som RNAi och transgenes och kommer att bidra till att förstå mekanismerna bakom insekternas tidiga utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
TO och TD stöddes av JSPS KAKENHI:s bidragsnummer 19H02970 respektive 20H02999.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
- Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019 (2019).
- Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect. Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).
- Farris, S. M. Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect. Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).
- Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica. Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).
- Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).
- Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution. Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).
- Nji, C., et al. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Brand, P., et al. The origin of the odorant receptor gene family in insects. eLife. 7, 1-13 (2018).
- Noble-Nesbitt, J. Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere. Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).
- Sweetman, H. L. Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).
- Nijhout, H. F. Insect Hormones. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Chen, J., et al. Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations. DNA Research. 19, 423-433 (2012).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).
- Adams, J. A. Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard. Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).
