Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Derivatisering av proteinkrystaller med I3C ved hjelp av tilfeldig mikroseede matrix screening

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61894
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2, 1
1School of Biological Sciences, The University of Adelaide, 2Institute of Photonics and Advanced Sensing (IPAS), School of Biological Sciences, The University of Adelaide
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikkelen presenterer en metode for å generere proteinkrystaller derivatisert med I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisoftalsyre) ved hjelp av mikroseeding for å generere nye krystalliseringsforhold i sparsomme matriseskjermer. Brettene kan settes opp ved hjelp av flytende dispenseringsroboter eller for hånd.

Abstract

Proteinstrukturbelysning ved hjelp av røntgenkrystallografi krever både høykvalitets diffracting krystaller og beregningsløsning av diffraksjonsfaseproblemet. Nye strukturer som mangler en passende homologimodell blir ofte derivatisert med tunge atomer for å gi eksperimentell faseinformasjon. Den presenterte protokollen genererer effektivt derivatiserte proteinkrystaller ved å kombinere tilfeldig mikroseederende matrisescreening med derivatisering med et tungt atommolekyl I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisoftalsyre). Ved å innlemme I3C i krystallgitteret, kan diffraksjonsfaseproblemet effektivt løses ved hjelp av enkelt bølgelengde uregelmessig dispergering (SAD) innfasing. Den likesidesidet trekantarrangement av jodatomer i I3C gir rask validering av en korrekt uregelmessig understruktur. Denne protokollen vil være nyttig for strukturelle biologer som løser makromolekylære strukturer ved hjelp av krystallografibaserte teknikker med interesse for eksperimentell innfasing.

Introduction

Innen strukturell biologi anses røntgenkrystallografi som gullstandardteknikken for å bestemme atomoppløsningsstrukturene til makromolekyler. Det har blitt brukt mye for å forstå det molekylære grunnlaget for sykdommer, veilede rasjonelle legemiddeldesignprosjekter og belyse den katalytiske mekanismen til enzymer1,2. Selv om strukturelle data gir et vell av kunnskap, kan prosessen med proteinuttrykk og rensing, krystallisering og strukturbestemmelse være ekstremt arbeidskrevende. Det oppstår ofte flere flaskehalser som hindrer fremdriften i disse prosjektene, og dette må tas opp for å effektivisere krystallstrukturbestemmelsesrørledningen.

Etter rekombinant uttrykk og rensing må foreløpige forhold som bidrar til krystallisering identifiseres, noe som ofte er et krevende og tidkrevende aspekt ved røntgenkrystallografi. Kommersielle sparsomme matriseskjermer som konsoliderer kjente og publiserte forhold er utviklet for å lette denne flaskehalsen3,4. Det er imidlertid vanlig å generere få treff fra disse første skjermene til tross for å bruke svært rene og konsentrerte proteinprøver. Observere klare dråper indikerer at proteinet ikke kan nå nivåene av supermetning som kreves for å kjerne en krystall. For å oppmuntre krystall kjerner og vekst, frø produsert fra eksisterende krystaller kan legges til forholdene, og dette gir mulighet for økt prøvetaking av krystallisering plass. Ireton og Stoddard introduserte først mikrofrømatrisescreeningsmetoden5. Krystaller av dårlig kvalitet ble knust for å lage en frøbestand og deretter lagt systematisk til krystalliseringsforhold som inneholder forskjellige salter for å generere nye diffraksjonskvalitetkrystaller som ellers ikke ville ha dannet seg. Denne teknikken ble ytterligere forbedret av D'Arcy et al. som utviklet tilfeldig mikrofrømatrisescreening (rMMS) der frø ble introdusert i en ekstra matrisekrystalliseringsskjerm6,7. Dette forbedret kvaliteten på krystaller og økte antall krystalliseringstreff i gjennomsnitt med en faktor på 7.

Etter at krystaller er produsert og et røntgendiffraksjonsmønster oppnås, oppstår det en annen flaskehals i form av å løse "faseproblemet" . Under datainnsamlingsprosessen registreres intensiteten av diffraksjon (proporsjonal med amplitudens kvadrat) men faseinformasjonen går tapt, noe som gir opphav til faseproblemet som stopper umiddelbar strukturbestemmelse8. Hvis målproteinet deler høy sekvens identitet til et protein med en tidligere bestemt struktur, molekylær erstatning kan brukes til å estimerefaseinformasjon 9,10,11,12. Selv om denne metoden er rask og billig, kan modellstrukturer ikke være tilgjengelige eller egnet. Suksessen til homologi modellbasert molekylær erstatning metoden synker betydelig som sekvens identitet faller under 35%13. I fravær av en passende homologimodell kan ab initio metoder, som ARCIMBOLDO14,15 og AMPLE16,testes. Disse metodene bruker beregningsmessig spådde modeller eller fragmenter som utgangspunkt for molekylær erstatning. AMPLE, som bruker spådde lokkemodeller som utgangspunkt, sliter med å løse strukturer av store (> 100 rester) proteiner og proteiner som hovedsakelig β-ark. ARCIMBOLDO, som forsøker å passe små fragmenter for å utvide seg til en større struktur, er begrenset til høyoppløselige data (≤2 Å) og av algoritmenes evne til å utvide fragmentene til en full struktur.

Hvis molekylære erstatningsmetoder mislykkes, må direkte metoder som isomorfe erstatning17,18 og uregelmessig spredning ved en enkelt bølgelengde (SAD19) eller flere bølgelengder (MAD20) brukes. Dette er ofte tilfelle for virkelig nye strukturer, hvor krystallen må dannes eller utledes med et tungt atom. Dette kan oppnås ved å bløtlegge eller samtidig krystallisere med en tung atomforbindelse, kjemisk modifikasjon (for eksempel 5-bromouracil inkorporering i RNA) eller merket proteinuttrykk (som å innlemme selenometionin eller selenocystein aminosyrer i primærstrukturen)21,22. Dette kompliserer ytterligere krystalliseringsprosessen og krever ytterligere screening og optimalisering.

En ny klasse av innfasing forbindelser, inkludert I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid) og B3C (5-amino-2,4,6-tribromoisophthalic acid), tilbyr spennende fordeler over eksisterende phasingforbindelser 23,24,25. Både I3C og B3C har et aromatisk ringstillas med et vekslende arrangement av uregelmessige scattere som kreves for direkte innfasingsmetoder og amino- eller karboksylatfunksjonelle grupper som samhandler spesielt med proteinet og gir bindende stedspesifisitet. Den påfølgende likesidete trekantede ordningen av tungmetallgrupper muliggjør forenklet validering av innfasingsunderbygningen. I skrivende stund er det 26 I3C-bundne strukturer i Protein Data Bank (PDB), hvorav 20 ble løst ved hjelp av SAD-innfasing26.

Denne protokollen forbedrer effekten av strukturen bestemmelse rørledningen ved å kombinere metoder for tungmetall derivatization og rMMS screening for å samtidig øke antall krystallisering treff og forenkle krystall derivatization prosessen. Vi demonstrerte denne metoden var ekstremt effektiv med høne eggehvite lysozyme og et domene av en ny lysin protein fra bakteriofag P6827. Strukturløsning ved hjelp av den svært automatiserte Auto-Rickshaw strukturbestemmelsesrørledningen er beskrevet, spesielt skreddersydd for I3C-innfasingsforbindelsen. Det finnes andre automatiserte rørledninger som kan brukes som AutoSol28,ELVES29 og CRANK230. Ikke-helautomatiske pakker som SHELXC/D/E kan også brukes31,32,33. Denne metoden er spesielt gunstig for forskere som studerer proteiner som mangler homologe modeller i PDB, ved å redusere antall screening- og optimaliseringstrinn betydelig. En forutsetning for denne metoden er proteinkrystaller eller et krystallinsk bunnskudd av målproteinet, hentet fra tidligere krystalliseringsstudier.

Protocol

1. Eksperimentell planlegging og vurderinger

  1. Bruk eksisterende krystaller av protein av interesse, helst generert gjennom dampdiffusjon krystallisering. For en generalisert protokoll for dampdiffusjonkrystallisering, se Benvenuti og Mangani34. Andre metoder for krystallisering som mikrobatch under olje og fri grensesnitt diffusjon vil kreve høsting krystaller før knusing for å generere mikroseeds.
  2. I utarbeidelsen av en frølager, bruk krystaller av høyeste kvalitet som kan ofres. Krystall av høyeste kvalitet kan bedømmes visuelt basert på morfologi, eller den beste diffracting krystall kan velges, hvis slike data er tilgjengelige. Det er svært sannsynlig at enda bedre kvalitet krystaller oppnås etter optimalisering gjennom seeding. I tilfelle der ingen krystaller er tilgjengelige, kan krystallinsk bunndemp som spherulites og nåler brukes.
  3. Identifiser saltkrystaller. Saltkrystaller kan vokse i krystalliseringsskjermer og kan se ut som proteinkrystaller. Bruk av saltkrystaller i rMMS vil ikke gi noen fordel og vil kaste bort dyrebar prøve, så det er viktig å eliminere salt falske positive.
    1. Saltkrystaller er høyt når de knuses. Krystaller må knuses for å generere en frølager, så denne strategien er spesielt relevant. Hvis en hørbar sprekklyd høres når du knuser krystallene, vil krystallen sannsynligvis være salt.
    2. Hvis proteinet inneholder tryptofan og tyrosinrester, bruk ultrafiolett fluorescensmikroskopi for å identifisere proteinkrystaller som fluorescerer under disse lysforholdene.
    3. Bruk Izit fargestoff (metylen blå) for å flekke proteinkrystaller for å skille dem til saltkrystaller som forblir relativt uopphetet. Denne prosedyren er imidlertid mer ødeleggende og anbefales bare hvis man har krystaller til overs fra repliker av samme fall.
      MERK: Selv om de nevnte testene kan gi lovende resultater, kan saltkrystaller fortsatt forveksles med proteinkrystaller. I dette tilfellet kan diffraksjonseksperimenter brukes til å definitivt skjelne mellom et protein og saltkrystall.

2. Utarbeidelse av litium I3C lager

  1. Mål ut 120 mg I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisoftalsyre) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  2. Oppløs I3C i 200 μL av 2 M litiumhydroksid. Oppløsningen kan forsiktig varmes opp ved hjelp av en varmeblokk ved 40-60 °C for å oppmuntre til oppløsning. Den resulterende litium-I3C-løsningen skal være brun og har en konsentrasjon på 1 M.
    FORSIKTIG: Litiumhydroksid er etsende. Vernebriller, hansker og en labfrakk skal brukes.
  3. Mål pH-en til løsningen. Tilsett eventuelt små mengder 1 M saltsyre eller 2 M litiumhydroksid for å justere pH-en til mellom 7 og 8. Tilsett milliQ vann for å gjøre det endelige oppløsningsvolumet til 400 μL. Konsentrasjonen av I3C lagerløsningen er 0,5 M.
    MERK: Trinn 2.3 er valgfritt. Oppløsningens pH skal være mellom pH 7-8 før pH-justering. Dette trinnet bør utføres hvis proteinet av interesse er sterkt påvirket av pH. Protokollen kan settes på pause her. Litium I3C kan holdes i mørket ved 4 °C i minst to uker35.

3. Tillegg av I3C til proteinbestanden

  1. Metode 1
    1. Tilsett lager litium I3C til en 150 μL aliquot av målet protein. Den endelige konsentrasjonen skal være mellom 5-40 mM litium I3C.
  2. Metode 2 (mildere metode)
    1. Forbered en proteinfortynningsbuffer som samsvarer med bufferen til målproteinet. Til denne fortynningsbufferen, legg til lager litium I3C for å gi en konsentrasjon av litium I3C mellom 10-80 mM.
    2. Fortynn proteinet 1:1 med proteinfortynningsbuffer for å gi en endelig konsentrasjon av litium I3C mellom 5-40 mM.
      MERK: Noen proteiner vil utløse ved å komme i kontakt med høye konsentrasjoner av litium I3C i metode 1, mens andre proteiner kan tolerere det. Metode 2 reduserer sannsynligheten for nedbør. Denne metoden halverer imidlertid proteinkonsentrasjonen. For proteiner som ikke har en etablert krystalliseringsprotokoll, anbefales en proteinkonsentrasjon på 10 mg/ml vanligvis for innledende krystalliseringsscreening. Et innledende molarforhold på I3C og protein på 8 anbefales. Proteinkonsentrasjon og molarforhold på I3C og protein kan optimaliseres etter den første skjermen.

4. Lage en frø lager

  1. Lag en avrundet sonde for å knuse krystaller.
    1. Med en Bunsen brenner på den blå flammen, varme en Pasteur pipette mot midten. Bruk en pinsett til å trekke enden av Pasteur pipetten for å trekke den ut i en tynn diameter på mindre enn 0, 3 mm.
    2. Når midtseksjonen er tynn nok, hold det segmentet i flammen for å skille pipetten på dette punktet og rundt enden av pipetten for å fullføre glasssonden.
      MERK: Avrundede sondekrystallknusere selges av tredjepartsleverandører. Dette er et alternativ til å lage avrundede sonder.
  2. Plasser fem 1,5 ml mikrocentrifuge rør på is.
  3. Under et lett mikroskop, undersøk krystalliseringsbrettet for en passende tilstand for å generere mikrokrystaller. Ideelt sett velges gode morfologi store krystaller. Denne teknikken fungerer imidlertid også med dårlige morfologikrystaller, nåler, plater, mikrokrystaller og sfærlitter.
  4. Åpne krystalliseringsbrettet godt. For 96 godt krystallisering skuffer forseglet med plast, bruk en skalpell for å kutte plast tetting brønnen. For hengende dråpebrett forseglet med fett, kan dekkslipsen fjernes ved hjelp av pinsett og invertert på en jevn overflate.
  5. Overfør 70 μL reservoarløsning til et mikrocentrifugerør og avkjøl det på is. Til de andre mikrocentrifugerørene legger du til 90 μL reservoarløsning og går tilbake til is for å kjøle seg ned.
    MERK: Hvis reservoaret ikke har nok volum eller ikke eksisterer (i tilfelle mikrobatch under olje), må du lage krystalliseringsreservoar ved å blande de riktige reagensene.
  6. Agitate krystallen i dråpen ved hjelp av krystallsonden for å knuse den grundig. Krystallen må knuses helt som kan overvåkes under mikroskopet.
  7. Fjern all væsken fra dråpen og overfør den til mikrocentrifugerøret med reservoarløsningen. Bland og ta deretter 2 μL blanding fra mikrocentrifugerøret og legg den tilbake til brønnen. Skyll brønnen med løsningen og overfør den til mikrocentrifugerøret. Gjenta dette skylletrinnet igjen. Fra dette punktet, hold mikrocentrifugerøret kaldt for å unngå å smelte mikroseedene i blandingen.
  8. Vortex røret ved maksimal hastighet ved 4 °C i 3 min, og stopp regelmessig for å kjøle røret på isen for å unngå overoppheting.
    MERK: Noen mikrofrøprotokoller legger til en polytetrafluoretylenfrøperle til mikrocentrifugerøret for å hjelpe krystallknusing7,36. Vi har ansatt teknikken uten bruk av en frøperle med suksess, men ser ingen problemer med å utnytte en frøperle for å knuse krystaller.
  9. Lag en 1 av 10 seriell fortynning av frøbestanden ved å overføre 10 μL mellom de kjølte reservoarløsningene.
  10. Oppbevar frøbestander som ikke vil bli brukt umiddelbart ved -80 °C.

5. Sette opp en rMMS-skjerm

  1. Sette opp en 96 brønn screening plate ved hjelp av en flytende dispensering robot. I fravær av en robot kan en flerkanals pipette også brukes.
    1. Overfør 75 μL fra en dyp brønnblokk til et 96 godt krystalliseringsbrett. Tilsett 1 μL til krystalliseringsfallet og 74 μL i reservoaret.
    2. Overfør 1 μL protein supplert med litium I3C, laget i trinn 2, til krystalliseringsfallet.
    3. Overfør 0,1 μL frølager til krystalliseringsfallet.
    4. Forsegle platen med klar tetningstape og inkuber platen ved en konstant temperatur for å tillate krystallvekst.
  2. Sette opp en hengende slippskjermer
    1. Smør kantene på hengende dråpebrønner (hengende drop krystallisering skuffer kan bli funnet i 24 og 48 brønnformater).
    2. Overfør 500 μL krystalliseringsløsning til reservoar.
    3. Nær midten av et glassdeksel lysbilde, plasser en 1 μL dråpe protein supplert med litium I3C, laget i trinn 2.
    4. Tilsett 1 μL av krystalliseringsløsningen til dråpen.
    5. Overfør 0,1 μL frølager til krystalliseringsfallet.
    6. Inverter dekselet og forsegle krystalliseringen godt ved å skyve dekselet gli inn i fettet.
    7. Inkuber platen ved en konstant temperatur for å tillate krystallvekst.
      MERK: Med nye og utestede frøaksjer anbefales det å bruke den mest konsentrerte frøbestanden for å maksimere sjansene for å få krystalliseringstreff. Etterfølgende forhold kan settes opp med redusert frøkonsentrasjon for å optimalisere antall krystaller.
  3. Inspiser krystallskuffer under et mikroskop regelmessig for krystallvekst. Hvis krystaller er av tilstrekkelig kvalitet, kan de høstes for datainnsamling. Krystaller kan også brukes til å generere nye frøaksjer og nye rMMS-skjermer for å tillate iterativ optimalisering.

6. Datainnsamling

  1. Harvest krystaller ved hjelp av kryoloops, kryobeskytte krystaller og flash kjøle dem i flytende nitrogen. For ytterligere informasjon om flash kjølekrystaller, se Teng37 og Garman og Mitchell38.
    1. Under kryobeskyttelsesstadiet, hvis krystallen passeres gjennom en ny vandig løsning, kan I3C gå tapt fra krystallen på grunn av at den leeching inn i kryobeskyttelsesløsningen. Bruk litium-I3C i kryobeskyttelsesløsningen i en konsentrasjon som samsvarer med krystalliseringstilstanden for å redusere dette.
    2. Krystaller dyrket ved hjelp av denne protokollen har med hell blitt kryobeskyttet ved hjelp av Parabar 10312 oljebasert kryobeskyttende (Hampton Research).
      MERK: Protokollen kan settes på pause her mens krystaller lagres i flytende nitrogen.
      FORSIKTIG: Flytende nitrogen kan forårsake kalde forbrenninger. Flytende nitrogen kan også forårsake kvelning hvis det brukes i lukkede rom.
  2. Monter krystallen på røntgenkildegoniometeret og samle inn diffraksjonsdata ved hjelp av protokollen som er spesifikk for røntgenkilden.
  3. Denne teknikken er avhengig av uregelmessig signal fra jodatomer i I3C. Dermed velger du energien til røntgenbildet for å maksimere dette signalet.
    1. Sett synchrotron røntgenkilder med justerbare energier så lavt som mulig. For mange makromolekylære krystallografistrålelinjer er den laveste konfigurerbare energien 8000 til 8500 eV.
    2. Roterende anode røntgenkilder kan ikke justeres. Vanlige anodkilder med kobber har Kα-kanten ved 8046 eV, noe som gir et godt uregelmessig signal for jod (f" = 6,9 e). Anodekilder med krom har en Kα-kant ved 5415 eV, noe som gir et stort uregelmessig signal for jod (f" = 12,6 e).
  4. Strålingsskader er et betydelig problem under datainnsamling, da det vil forringe det uregelmessigesignalet 39. Velg eksponeringstid og demping av strålen for å oppnå den beste diffraksjonen samtidig som strålingsdosen minimeres.
    MERK: I en lignende innfasingsforbindelse med jodatomer erstattet med bromatomer, har strålingsskader vist seg å forårsake radiolyse av karbonbro brombindingen og en reduksjon i belegget til bromatomer24.
    1. Bruk inverse beam SAD datainnsamling som en innsamlingsstrategi. Dataene samles inn i kiler, med motsatte kiler samlet etter hverandre. Dette gjør at Friedel par kan samles med en tilsvarende dose, noe som resulterer i en forbedret måling av uregelmessig signal mindre påvirket av strålingsskader. For eksempel, en åtte kile strategi for å samle 360° ville innebære å samle inn dataene i rekkefølgen av kile 1 (0 °-45°), kile 2 (180°-225°), kile 3 (46°-90°), kile 4 (225°°-270°), kile 5 (90°-135°), kile 6 (270°-315°), kile 7 (135°-180°) og kile 8 (315°-360°).
      MERK: Kontinuerlig rotasjon er en alternativ innsamlingsstrategi til datainnsamling av inverse stråler. For en nylig sammenligning av innsamlingsstrategiene, se Garcie-Bonte & Katona40.

7. Databehandling og strukturløsning

  1. Utfør datareduksjon på diffraksjonsdataene ved hjelp av XDS41, med sikte på å maksimere det uregelmessige signalet. Parametere for inndatareduksjon er spesifikke for datasettet og kan kreve litt prøving og feiling. Her er noen anbefalinger for å starte.
    1. Sett FRIEDEL'S LAW = FALSE. Utfør RIKTIG to ganger, STRICT_ABSORPTION_CORRECT = SANN og STRICT_ABSORPTION_CORRECT = USANN. Ett løp kan ha et høyere uregelmessig signal enn det andre. Sammenlign de uregelmessige signalene mellom løpene ved hjelp av 'Anomal Corr' og 'SigAno' disipliner i produksjonen. Dette gir en indikator på datakvalitet.
    2. Kjør SHELXC på XDS_ASCII. HKL-fil for en mer nøyaktig indikasjon på uregelmessig signal. "Ranom"-disiplinen vil gi en indikasjon på det uregelmessige signalet ved ulike oppløsninger.
  2. Kjør POINTLESS42 og AIMLESS43 for å skalere dataene. I AIMLESS angir du parameteren ANOMALOUS ON. Hvis GUI brukes, velger du alternativet Skill uregelmessige par for ytre avvisning og sammenslåing av statistikk. Testing av ulike oppløsningskutt kan være nødvendig for å maksimere avvikende signal.
  3. Løs proteinstrukturen ved hjelp av Auto-Rickshaw automatisert krystallstrukturbestemmelsesrørledning44. Auto-Rickshaw vil forsøke å løse faseproblemet og bygge proteinets krystallstruktur automatisk med proteinmodellerings- og raffinementprogramvare.
    1. For proteiner uten en homologi modell mal, kjøre SAD protokollen auto-Rickshaw i avansert modus. Angi de nødvendige parameterne.
      1. Velg PROTEIN som molekyltype.
      2. Skriv inn datainnsamlingen i angstroms (Å).
      3. Velg "I" som understrukturelement for å indikere jodatomer ble brukt.
      4. Velg "i3c" som understrukturtype for å indikere at I3C var innfasingsmolekylet.
      5. Velg "sub_direct" som bestemmelsesmetode for understruktur. Denne metoden bruker SHELXD32 til å søke etter understrukturen.
      6. Velg "3" som antall forventede understruktur per monomer.
      7. Skriv inn "1" som oppløsningsavskjæring av understruktursøk. Dette gjør at Auto-Rickshaw automatisk kan bestemme en passende oppløsning cutoff.
      8. Skriv inn antall rester i en enkelt monomer, romgruppe av datasettet og antall molekyler i den asymmetriske enheten basert på Matthews-koeffisienten.
      9. Velg riktig formidlingsnivå for røntgendata som passer til behovene. Ved å velge "AutoRickshaw-utviklere" kan Auto-Rickshaw-utviklere feilsøke kjøringen hvis det oppstår problemer.
      10. Skriv inn de uregelmessige dataene som en mtz-fil.
      11. Skriv inn proteinsekvensen som en seq-, pir- eller txt-fil. En seq-fil kan genereres i et tekstredigeringsprogram (for eksempel Notepad ++9 på Windows eller nano i Linux). Opprett en ny fil, skriv inn den primære sekvensen av proteinet som en lang linje eller atskilt med linjeskift. Lagre filen med den .seq filtypen.
      12. Skriv inn en institusjonell e-postadresse.
  4. Resultatene leveres via en webkobling som sendes til den oppgitte e-postadressen.
    MERK: AutoRickshaw er en automatisert rørledning som påkaller ulike krystallografi programvarepakker for å løse en røntgen krystall struktur32,33,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58. Hvis Auto-Rickshaw-kjøringen ikke løser strukturen, kan andre Auto-Rickshaw-innstillinger testes. Metoden for bestemmelse av struktur kan endres til "sub_phassade" for å bruke Phaser59 i stedet for SHELXD32. Antall forventede understrukturer per monomer kan også økes eller reduseres.
  5. Under den eksperimentelle innfasingen av krystallstrukturen vil Auto-Rickshaw forsøke å plassere tunge atomer i enhetscellen, noe som skaper en understruktur. Den likesidesidete trekantordningen av jodatomer i I3C presenterer en effektiv måte å validere understrukturen på. Hvis trinn 6.3 mislykkes, kan validering av understrukturen hjelpe til med å feilsøke strukturløsning.
    1. Last ned listen over tunge atomnettsteder fra Auto-Rickshaw-resultatsiden. Det er en hyperkobling som kalles "tunge atomområder". Dette vil laste ned en tekstfil med de tunge atomnettstedene.
    2. Endre filtypen til filen fra .txt til .pdb.
    3. Åpne filen PDB i Coot60. Slå på symmetri for å se andre tunge atomer fra nærliggende asymmetriske enheter.
    4. Mål avstandene mellom de tunge atomer, inkludert på tvers av asymmetriske enheter. I3C vil vises som en likeside trekant med en sidelengde på 6 angstroms. Tilstedeværelsen av en trekant med disse dimensjonene indikerer plasseringene av de tunge atomer er riktige.

Representative Results

Innlemme I3C i rMMS kan generere nye forhold som støtter derivatisert krystallvekst
Effekten av samtidig rMMS screening og I3C-derivatisering ble demonstrert i to proteiner, høneeggehvite lysozym (HEWL, oppnådd som et lyofilisert pulver) og det antatte Orf11 lysin N-terminaldomenet (Orf11 NTD) fra bakteriofage P68. Hvert protein ble screenet mot PEG/ION HT under fire forskjellige forhold, inkludert: usett, seeded, usett med I3C og seeded med I3C (figur 1). For begge proteinene økte ikke det eneste tillegget av I3C antall forhold som bidrar til krystallisering. Når det gjelder Orf11 NTD, ble bare en egnet tilstand identifisert med og uten I3C (figur 1B). Da I3C ble lagt til HEWL-skjermene, ble antall treff redusert fra 31 til 26, noe som fremhevet de ekstra kompleksitetene ved krystallisering ved innføring av innfasingsforbindelser (figur 1A). I samsvar med andre studier, legge frø til kommersielle sparsomme matrise skjermer for å generere en rMMS skjerm betydelig økt antall mulige krystallisering forhold for begge proteiner, noe som resulterer i en 2.1 og 6 fold økning for HEWL og Orf11 NTD,henholdsvis 6,61 ( Figur1). Viktigst, samtidig tillegg av I3C og frø økte antall treff i forhold til en useeded skjerm, viser en 2,3 og 7 ganger økning for HEWL og Orf11 NTD, henholdsvis. Mange av krystallene fra rMMS i nærvær av I3C viser utmerket krystallmorfologi (figur 2).

Seeding gir nøye kontroll av krystallnummer i I3C rMMS-skjermer
I mikrofrøeksperimenter kan antall frø introdusert i en krystalliseringsstudie kontrolleres ved fortynning av frøbestanden, og dette gir presis kontroll av kjerner idråpe 7,36. Dette gjør det ofte mulig for større krystaller å danne siden det er redusert konkurranse av proteinmolekyler på kjernesteder. Denne fordelen strekker seg også til I3C-rMMS-metoden og har blitt demonstrert med hell i både HEWL og Orf11 NTD. Rekreasjon av en krystallisering tilstand identifisert fra I3C-rMMS skjermen med en fortynnet frø lager ga færre, men større krystaller (Figur 3).

SAD innfasing kan brukes til å løse strukturer fra krystaller avledet fra rMMS I3C-skjermen
Krystaller dyrket ved hjelp av fortynnet frø lager vist i figur 3 ble brukt til å løse strukturen av proteiner ved hjelp av SAD innfasing ved hjelp av diffraksjon data fra en enkelt krystall (Figur 4). Data ble samlet inn på den australske Synchrotron MX1 beamline62. Detaljerte detaljer om datainnsamling og strukturløsning er beskrevet andre steder27.

Figure 1
Figur 1 - rMMS ble brukt til å generere nye forhold for krystallvekst i nærvær av I3C for to testproteiner. 96 brønndiffusjon krystallisering skjermer ble utført ved hjelp av kommersielle sparsomme matrise skjermer. (A) Høneeggehvite lysozym ble testet med Index HT-skjermen. Skuffer ble seeded med HEWL krystaller dyrket i 0,2 M ammonium tartrat dibasic pH 7,0, 20% (w / v) polyetylenglykol 3350. (B) Orf11 NTD fra bakteriofage P68 ble testet med PEG/ION-skjermen. Orf11 NTD skuffer ble seeded fra krystaller fra tilstand G12 fra usett skjerm, vist i blått. Forhold som støtter krystallvekst er vist i rødt. rMMS seeding i nærvær og fravær av I3C begge ga betydelig flere krystall treff enn usette skuffer. Figur tilpasset fra Truong et al.27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 - Representative bilder av krystaller dyrket fra dampdiffusjonsforsøkene vist i figur 1 (a) og (b). Figur tilpasset fra Truong et al.27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 - Fortynning av frøbestanden er en effektiv måte å redusere kjerner i en krystalliseringstilstand som finnes ved hjelp av I3C-rMMS-metoden, for å kontrollere antall krystaller som dannes. Å redusere kjerner i en dråpe fører ofte til at krystaller vokser til større dimensjoner. Figur tilpasset fra Truong et al.27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) og HEWL (PDB ID 6PBB) ble krystallisert ved hjelp av I3C-rMMS-metoden og løst ved hjelp av Auto-Rickshaw SAD-innfasing. (A) Båndstrukturer av HEWL og Orf11 NTD løst gjennom eksperimentell innfasing. (B) I3C molekyl bundet til HEWL og Orf11 NTD. (C) Uregelmessige jodatomer i I3C er arrangert i en likesidet trekant på 6 Å. Dermed indikerer tilstedeværelsen av denne trekanten i innfasingsunderbygningen at det er et I3C-molekyl i den posisjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Strukturbestemmelse av et nytt protein i fravær av en passende homologimodell for molekylær utskifting krever eksperimentell innfasing. Disse metodene krever inkorporering av tunge atomer i proteinkrystallen som legger til et nivå av kompleksitet til strukturbestemmelsesrørledningen og kan introdusere mange hindringer som må løses. Tunge atomer kan innlemmes direkte i proteinet gjennom merket uttrykk ved hjelp av selenometionin og selenocystein. Siden denne metoden er kostbar, arbeidskrevende og kan resultere i lavere proteinutbytter, uttrykkes ofte merket protein etter at krystalliseringsforholdene er funnet og optimalisert med umerket protein. Alternativt kan krystaller utledes ved å bløtlegge i en løsning som inneholder tunge atomer22,63,64. Denne metoden bruker ofte krystaller av høy kvalitet og utføres derfor etter at en robust krystalliseringsmetode allerede er utviklet. Vellykket å skaffe en derivatisert krystall ved hjelp av denne metoden krever ytterligere optimalisering av soaking prosedyrer og screening av ulike innfasing forbindelser, derfor legge mer tid til en allerede arbeidskrevende prosess.

Samtidig krystallisering av proteinet med det tunge atomet kan utføres på screeningstadiet, og dermed effektivt effektivisere prosessen og redusere krystallmanipuleringstrinn som kan forårsake skade. Det finnes imidlertid fortsatt det potensielle scenariet for å få få innledende krystalliseringstreff og problemet med å velge en kompatibel tung atomforbindelse. Mange tilgjengelige innfasingsforbindelser er for tiden uforenlige med stup, buffere og tilsetningsstoffer som vanligvis finnes i krystalliseringsforhold. De kan være uoppløselige i sulfat- og fosfatbuffere, chelate for å sitere og acetat, reagere ugunstig med HEPES og Tris buffere eller bli beslagt av DTT og β-mercaptoethanol21. Siden I3C-innfasingsforbindelsen ikke lider av disse inkompatibilitetene, er det en robust innfasingsforbindelse som kan være mottagelig for mange forskjellige forhold.

I denne studien presenteres en strømlinjeformet metode for å produsere derivatiserte krystaller klar for SAD-innfasing gjennom samtidig Kombinasjonen av begge teknikkene øker antall krystalliseringstreff, med mange av forholdene som har forbedret morfologi og diffraksjonsegenskaper. I både Orf11 NTD- og HEWL-testtilfeller ble det identifisert nye betingelser i I3C-rMMS-skjermen som var fraværende da I3C ikke var til stede. Potensielt kan I3C binde seg gunstig til proteinet, noe som letter dannelsen og stabiliseringen av krystallkontakter27. I sin tur kan dette indusere krystallisering og muligens forbedre diffraksjonsegenskapene. Foruten å være en forbindelse kompatibel med sparsomme matriseskjermer, er I3C også en attraktiv innfasingsforbindelse på grunn av sine indre egenskaper. De funksjonelle gruppene som veksler med jod på det aromatiske ringstillaset tillater spesifikk binding til proteiner. Dette fører til større belegg og reduserer potensielt bakgrunnssignal23. Videre er arrangement av uregelmessige scatterers i en likesidet trekant åpenbar i understrukturen og kan brukes til raskt å validere binding av I3C (figur 4B og 4C). Til slutt kan det produsere et uregelmessig signal med tunable synchrotron stråling samt krom og kobber roterende anode røntgenkilder. Dermed kan det brukes på mange forskjellige arbeidsflyter. Som I3C er allment tilgjengelig og billig å kjøpe, er denne tilnærmingen innen rekkevidde for de fleste strukturelle biologilaboratorier.

Det er flere eksperimentelle hensyn som må tas opp ved bruk av I3C-rMMS-metoden. Denne metoden kan ikke brukes hvis det første krystallinske materialet i proteinet ikke kan oppnås. I vanskelige tilfeller kan krystallinsk materiale fra et homologt protein også brukes til å generere frølager. Denne kryssseede tilnærmingen til rMMS har vist noen lovende resultater7. Optimalisering av krystallnummer gjennom fortynning av frøbestanden er et avgjørende skritt, som ikke bør overses, for å maksimere sjansen for å produsere store krystaller av høy kvalitet og anskaffe egnede diffraksjonsdata. Hvis det er få I3C-steder identifisert i den asymmetriske enheten, bør forhold som bidrar til krystallisering optimaliseres ytterligere med økt konsentrasjon av I3C. Dette kan øke belegget til I3C for å maksimere det uregelmessige signalet og hjelpekrystallderivatiseringen.

Det kan være tilfeller der denne teknikken kanskje ikke er den optimale metoden for å derivatisere proteinkrystaller. Etter hvert som størrelsen på et protein eller proteinkompleks øker, kan det begrensede antallet I3C-steder på proteinoverflaten ikke gi tilstrekkelig innfasingskraft til å løse strukturen. I disse scenariene hvor proteinstørrelse mistenkes for å hindre innfasing, kan selenometionmerking av proteinet være en mer levedyktig tilnærming til innfasing av proteinet. Hvis proteinet har tilstrekkelig antall metioninrester i proteinet (anbefalt å ha minst en metionin per 100rester 65) og høy effektivitet selenometion inkorporering i et protein kan oppnås (for eksempel i bakterielleuttrykkssystemer 66),vil flere høy belegg selen atomer være til stede i krystallene for å fase strukturen.

I tillegg kan noen proteiner iboende være uegnet for derivatisering med I3C. I3C bindende steder på proteiner er avhengig av proteinstruktur. Det kan finnes proteiner som naturlig har få eksponerte patcher som er kompatible med I3C-binding. Dermed er det ikke uforutsette at det kan være vanskeligheter med å samtidig krystallisere noen målproteiner med I3C.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble utført på MX1-strålelinjen ved den australske Synchrotron, en del av ANSTO. Forfatterne ønsker å anerkjenne medlemmer av Shearwin og laboratorier for diskusjoner om dette arbeidet. Forfatterne ønsker også å anerkjenne Dr. Santosh Panjikar og Dr. Linda Whyatt-Shearwin som bidro til det opprinnelige arbeidet som var banebrytende for denne protokollen.

Følgende finansiering er anerkjent: Australian Research Council (grant Nos. DP150103009 og DP160101450 til Keith E. Shearwin); University of Adelaide (Australian Government Research Training Program stipend stipend til Jia Quyen Truong og Stephanie Nguyen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL disposable luer lock syringes Adelab Scientific T3SS10LAT Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells
24 well tissue culture plate Sigma Aldrich CLS3527 Used for hanging drop crystal tray
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506 For 96 well crystallization screens set up by robot
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid Alfa Aesar B22178 Commonly referred to as I3C in the article
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original Hampton Research HR3-297 For 96 well crystallization screens set up by robot
Coverslips  Thermo Fisher Scientific 18X18-2 Coverslips for hanging drop crystal tray wells
Dow Corning vacuum grease Hampton Research HR3-510 Used for sealing hanging drop crystal tray wells
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL Eppendorf 3120000011
Gilson Pipette 2 μL-20 μL John Morris Group 1153247
Gilson Pipette 20 μL-200 μL John Morris Group 1152006
Glass pasteur pipettes Adelab Scientific HIR92601.01
Hen Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Approximately 95% pure
IndexHT screen Hampton Research HR2-134
Microscope illuminator Meiji Techno FT192/230 Light source to illuminate crystallography experiments
PEG/ION HT screen Hampton Research HR2-139
Phoenix Liquid Dispenser Art Robbins Instruments 602-0001-10
Scalpel with scalpel blade no. 15 Adelab Scientific LV-SMSCPO15
Seed bead kit Hampton Research HR2-320 Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.
Stereo microscope  Meiji Techno EMZ-5TR Microscope for visualising crystallography experiments
Tweezers Sigma-Aldrich T5415
Vortex mixer Adelab Scientific RAVM1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zheng, H., Hou, J., Zimmerman, M. D., Wlodawer, A., Minor, W. The future of crystallography in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (2), 125-137 (2014).
  2. Oakley, A. J., Wilce, M. C. J. Macromolecular crystallography as a tool for investigating drug, enzyme and receptor interactions. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 27 (3), 145-151 (2000).
  3. Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling. A screening method for crystallization of proteins. Journal of Applied Crystallography. 24, pt 4 409-411 (1991).
  4. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- To medium-sized academic laboratories: The PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (10), 1426-1431 (2005).
  5. Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (3), 601-605 (2004).
  6. D'Arcy, A., Villard, F., Marsh, M. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (4), 550-554 (2007).
  7. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).
  8. Taylor, G. The phase problem. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography. 59 (11), 1881-1890 (2003).
  9. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A. 46 (2), 73-82 (1990).
  10. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  11. Millán, C., Jiménez, E., Schuster, A., Diederichs, K., Usón, I. ALIXE: a phase-combination tool for fragment-based molecular replacement. Acta Crystallographica Section D. 76 (3), 209-220 (2020).
  12. Liebschner, D., et al. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: Recent developments in Phenix. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, 861-877 (2019).
  13. Abergel, C. Molecular replacement: Tricks and treats. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (11), 2167-2173 (2013).
  14. Pröpper, K., et al. Structure solution of DNA-binding proteins and complexes with ARCIMBOLDO libraries. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (6), 1743-1757 (2014).
  15. Rodríguez, D. D., et al. Crystallographic ab initio protein structure solution below atomic resolution. Nature Methods. 6 (9), 651-653 (2009).
  16. Bibby, J., Keegan, R. M., Mayans, O., Winn, M. D., Rigden, D. J. AMPLE: A cluster-and-truncate approach to solve the crystal structures of small proteins using rapidly computed ab initio models. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (12), 1622-1631 (2012).
  17. Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method. Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287-307 (1954).
  18. Blow, D. M., Rossmann, M. G. The single isomorphous replacement method. Acta Crystallographica. 14 (11), 1195-1202 (1961).
  19. Wang, B. C. Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography. Methods in Enzymology. 115, 90-112 (1985).
  20. Hendrickson, W. A. Determination of macromolecular structures from anomalous diffraction of synchrotron radiation. Science. 254 (5028), 51-58 (1991).
  21. Pike, A. C. W., Garman, E. F., Krojer, T., Von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).
  22. Dauter, Z., Dauter, M., Rajashankar, K. R. Novel approach to phasing proteins: Derivatization by short cryo-soaking with halides. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 56 (2), 232-237 (2000).
  23. Beck, T., Krasauskas, A., Gruene, T., Sheldrick, G. M. A magic triangle for experimental phasing of macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 64 (11), 1179-1182 (2008).
  24. Beck, T., Gruene, T., Sheldrick, G. M. The magic triangle goes MAD: Experimental phasing with a bromine derivative. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 374-380 (2010).
  25. Beck, T., Da Cunha, C. E., Sheldrick, G. M. How to get the magic triangle and the MAD triangle into your protein crystal. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (10), 1068-1070 (2009).
  26. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. , (2000).
  27. Truong, J. Q., Panjikar, S., Shearwin-Whyatt, L., Bruning, J. B., Shearwin, K. E. Combining random microseed matrix screening and the magic triangle for the efficient structure solution of a potential lysin from bacteriophage P68. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (7), 670-681 (2019).
  28. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: The PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 65 (6), 582-601 (2009).
  29. Holton, J., Alber, T. Automated protein crystal structure determination using ELVES. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (6), 1537-1542 (2004).
  30. Skubák, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nature Communications. 4, (2013).
  31. Sheldrick, G. M. Crystal structure refinement with SHELXL. Acta Crystallographica Section C: Structural Chemistry. 71, 3-8 (2015).
  32. Schneider, T. R., Sheldrick, G. M. Substructure solution with SHELXD. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1772-1779 (2002).
  33. Sheldrick, G. M. Macromolecular phasing with SHELXE. Zeitschrift fur Kristallographie. 217 (12), 644-650 (2002).
  34. Benvenuti, M., Mangani, S. Crystallization of soluble proteins in vapor diffusion for x-ray crystallography. Nature Protocols. , (2007).
  35. Beck, T. Sticky triangles New tools for experimental phasing of biological macromolecules. , (2010).
  36. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  37. Teng, T. -Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29, 584-587 (1996).
  39. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (4), 907-911 (2019).
  40. Garcia-Bonete, M. J., Katona, G. Bayesian machine learning improves single-wavelength anomalous diffraction phasing. Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances. 75, 851-860 (2019).
  41. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  44. Panjikar, S., Parthasarathy, V., Lamzin, V. S., Weiss, M. S., Tucker, P. A. Auto-Rickshaw: An automated crystal structure determination platform as an efficient tool for the validation of an X-ray diffraction experiment. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (4), 449-457 (2005).
  45. Jones, T. A., Thirup, S. Using known substructures in protein model building and crystallography. The EMBO journal. 5 (4), 819-822 (1986).
  46. Kleywegt, G. J., Jones, T. A. Template convolution to enhance or detect structural features in macromolecular electron-density maps. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 53 (2), 179-185 (1997).
  47. Perrakis, A., Morris, R., Lamzin, V. S. Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nature Structural Biology. 6 (5), 458-463 (1999).
  48. Morris, R. J., et al. Breaking good resolutions with ARP/wARP. Journal of Synchrotron Radiation. 11 (1), 56-59 (2004).
  49. Yao, D. Q., et al. SAD phasing by OASIS-2004: Case studies of dual-space fragment extension. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 883-890 (2006).
  50. Hao, Q. ABS: A program to determine absolute configuration and evaluate anomalous scatterer substructure. Journal of Applied Crystallography. 37 (3), 498-499 (2004).
  51. Collaborative Computational Project Number 4. The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (5), 760-763 (1994).
  52. Sheldrick, G. M., Hauptman, H. A., Weeks, C. M., Miller, R., Usón, I. Ab initio phasing. International Tables for Crystallography. , 333-345 (2006).
  53. Smith, G. D. Matching selenium-atom peak positions with a different hand or origin. Journal of Applied Crystallography. 35 (3), 368-370 (2002).
  54. Pannu, N. S., McCoy, A. J., Read, R. J. Application of the complex multivariate normal distribution to crystallographic methods with insights into multiple isomorphous replacement phasing. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography. 59 (10), 1801-1808 (2003).
  55. Pannu, N. S., Read, R. J. The application of multivariate statistical techniques improves single-wavelength anomalous diffraction phasing. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (1), 22-27 (2004).
  56. De La Fortelle, E., Bricogne, G. Maximum-likelihood heavy-atom parameter refinement for multiple isomorphous replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods. Methods in Enzymology. 276, 472-494 (1997).
  57. Cowtan, K. Joint CCP4 and ESF-EACBM Newsletter on Protein. Crystallography. 31, 34-38 (1994).
  58. Terwilliger, T. C. Maximum-likelihood density modification. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 56 (8), 965-972 (2000).
  59. Read, R. J., McCoy, A. J. Maximum-likelihood determination of anomalous substructures. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2018).
  60. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  61. Till, M., et al. Improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening. Journal of visualized experiments JoVE. (78), e50548 (2013).
  62. McPhillips, T. M., et al. Blu-Ice and the distributed control system: Software for data acquisition and instrument control at macromolecular crystallography beamlines. Journal of Synchrotron Radiation. 9 (6), 401-406 (2002).
  63. Nagem, R. A. P., Polikarpov, I., Dauter, Z. Phasing on Rapidly Soaked Ions. Methods in Enzymology. 374, 120-137 (2003).
  64. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  65. Hendrickson, W. A., Ogata, C. M. Phase determination from multiwavelength anomalous diffraction measurements. Methods in Enzymology. 276, 494-523 (1997).
  66. Doublié, S. Production of Selenomethionyl Proteins in Prokaryotic and Eukaryotic Expression Systems. Macromolecular Crystallography Protocols. Methods in Molecular Biology. , 91-108 (2007).

Tags

Biokjemi Utgave 167 seeding tilfeldig mikrofrømatrisescreening rMMS proteinkrystallografi innfasing Magic Triangle I3C
Derivatisering av proteinkrystaller med I3C ved hjelp av tilfeldig mikroseede matrix screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Truong, J. Q., Nguyen, S., Bruning,… More

Truong, J. Q., Nguyen, S., Bruning, J. B., Shearwin, K. E. Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (167), e61894, doi:10.3791/61894 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter