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Biochemistry

Derivatización de cristales proteicos con I3C mediante el cribado de matriz de microsemalla aleatoria

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61894
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2, 1
1School of Biological Sciences, The University of Adelaide, 2Institute of Photonics and Advanced Sensing (IPAS), School of Biological Sciences, The University of Adelaide
* These authors contributed equally

Summary

Este artículo presenta un método para generar cristales proteicos derivados con I3C (5-amino-2,4,6-ácido triiodoisophtalico) utilizando microsedizaciones para generar nuevas condiciones de cristalización en pantallas de matriz dispersas. Las bandejas se pueden configurar con robots dispensadores de líquidos o a mano.

Abstract

La elucidación de la estructura proteica mediante cristalografía de rayos X requiere tanto cristales difractantes de alta calidad como solución computacional del problema de la fase de difracción. Las estructuras novedosas que carecen de un modelo de homología adecuado a menudo se derivan con átomos pesados para proporcionar información de fase experimental. El protocolo presentado genera eficientemente cristales de proteínas derivados mediante la combinación de cribado aleatorio de matriz de microsedora con derivatización con una molécula de átomo pesado I3C (ácido 5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic). Al incorporar I3C en la celosía de cristal, el problema de la fase de difracción se puede resolver eficientemente utilizando una sola fase de dispersión anómala de longitud de onda (SAD). La disposición del triángulo equilátero de los átomos de yodo en I3C permite una validación rápida de una subestructura anómala correcta. Este protocolo será útil para los biólogos estructurales que resuelven estructuras macromoleculares utilizando técnicas basadas en cristalografía con interés en la fase experimental.

Introduction

En el campo de la biología estructural, la cristalografía de rayos X se considera como la técnica estándar de oro para determinar las estructuras de resolución atómica de las macromoléculas. Se ha utilizado ampliamente para entender la base molecular de las enfermedades, guiar proyectos de diseño racional de fármacos y dilucidar el mecanismo catalítico de las enzimas1,2. Aunque los datos estructurales proporcionan una gran cantidad de conocimientos, el proceso de expresión y purificación de proteínas, cristalización y determinación de la estructura puede ser extremadamente laborioso. Comúnmente se encuentran varios cuellos de botella que dificultan el progreso de estos proyectos y esto debe abordarse para agilizar eficientemente el gasoducto de determinación de la estructura cristalina.

Después de la expresión y purificación recombinantes, deben identificarse las condiciones preliminares que favorezcan la cristalización, que a menudo es un aspecto arduo y lento de la cristalografía de rayos X. Se han desarrollado pantallas de matriz dispersa comercial que consolidan las condiciones conocidas y publicadas para aliviar este cuello de botella3,4. Sin embargo, es común generar pocos impactos de estas pantallas iniciales a pesar de usar muestras de proteínas altamente puras y concentradas. Observar gotas claras indica que la proteína puede no estar alcanzando los niveles de supersaturación requeridos para nuclear un cristal. Para fomentar la nucleación cristalina y el crecimiento, las semillas producidas a partir de cristales preexistentes se pueden añadir a las condiciones y esto permite un mayor muestreo del espacio de cristalización. Ireton y Stoddard introdujeron por primera vez el método de cribado de matriz de microsedas5. Los cristales de mala calidad fueron triturados para hacer un stock de semillas y luego se añadieron sistemáticamente a las condiciones de cristalización que contienen diferentes sales para generar nuevos cristales de calidad de difracción que de otro modo no se habrían formado. Esta técnica fue mejorada aún más por D'Arcy et al. que desarrollaron cribado aleatorio de matriz de microsedas (rMMS) en el que las semillas se introdujeron en una pantalla de cristalización de matriz de repuesto6,7. Esto mejoró la calidad de los cristales y aumentó el número de impactos de cristalización en promedio en un factor de 7.

Después de que los cristales se producen con éxito y se obtiene un patrón de difracción de rayos X, se encuentra otro cuello de botella en forma de resolución del "problema de fase". Durante el proceso de adquisición de datos, se registra la intensidad de la difracción (proporcional al cuadrado de la amplitud) pero se pierde la información de fase, dando lugar al problema de fase que detiene la determinación inmediata de la estructura8. Si la proteína objetivo comparte una identidad de secuencia alta con una proteína con una estructura previamente determinada, se puede utilizar la sustitución molecular para estimar la información de fase9,10,11,12. Aunque este método es rápido y económico, las estructuras del modelo pueden no estar disponibles o no ser adecuadas. El éxito del método de reemplazo molecular basado en modelos de homología disminuye significativamente a medida que la identidad de la secuencia cae por debajo del 35%13. En ausencia de un modelo de homología adecuado, se pueden probar métodos ab initio, como ARCIMBOLDO14,15 y AMPLE16. Estos métodos utilizan modelos o fragmentos predichos computacionalmente como puntos de partida para el reemplazo molecular. AMPLE, que utiliza modelos de señuelo previstos como puntos de partida, lucha para resolver estructuras de proteínas y proteínas grandes (>100 residuos) que contienen predominantemente hojas de β. ARCIMBOLDO, que intenta encajar pequeños fragmentos para extenderse a una estructura más grande, se limita a los datos de alta resolución (≤2o) y a la capacidad de los algoritmos para expandir los fragmentos en una estructura completa.

Si los métodos de sustitución molecular fallan, deben utilizarse métodos directos como el reemplazo isomórfico17,18 y la dispersión anómala a una sola longitud de onda (SAD19)o de varias longitudes de onda (MAD20). Este es a menudo el caso de estructuras verdaderamente novedosas, donde el cristal debe ser formado o derivado con un átomo pesado. Esto se puede lograr empapando o co-cristalizando con un compuesto de átomo pesado, modificación química (como la incorporación de 5 bromouralo en el ARN) o la expresión de proteínas etiquetada (como la incorporación de selenomethionine o aminoácidos de selenocisteína en la estructura primaria)21,22. Esto complica aún más el proceso de cristalización y requiere cribado y optimización adicionales.

Una nueva clase de compuestos de fase, incluyendo I3C (5-amino-2,4,6-ácido triiodoisofáltico) y B3C (5-amino-2,4,6-ácido tribromoisophálico), ofrecen ventajas emocionantes sobre los compuestos de fase preexistentes23,24,25. Tanto I3C como B3C cuentan con un andamio de anillo aromático con una disposición alterna de dispersiones anómalas necesarias para los métodos de fase directa y los grupos funcionales de aminoácidos o carboxilatos que interactúan específicamente con la proteína y proporcionan especificidad del sitio de unión. La posterior disposición triangular equilátero de los grupos de metales pesados permite una validación simplificada de la subestructura de fase. En el momento de la redacción, hay 26 estructuras enlazadas a I3C en el Banco de Datos de Proteínas (PDB), de las cuales 20 se resolvieron utilizando la fase SAD26.

Este protocolo mejora la eficacia de la tubería de determinación de la estructura mediante la combinación de los métodos de derivación de metales pesados y cribado rMMS para aumentar simultáneamente el número de golpes de cristalización y simplificar el proceso de derivación de cristal. Demostramos que este método era extremadamente eficaz con la lisoz de la clara de huevo de gallina y un dominio de una nueva proteína de lesina de bacteriófago P6827. Se describe la solución de estructura mediante la tubería de determinación de estructura Auto-Rickshaw altamente automatizada, específicamente adaptada para el compuesto de fase I3C. Existen otras canalizaciones automatizadas que se pueden utilizar como AutoSol28,ELVES29 y CRANK230. Los paquetes no totalmente automatizados como SHELXC/D/E también se pueden utilizar31,32,33. Este método es particularmente beneficioso para los investigadores que están estudiando proteínas que carecen de modelos homólogos en la PDB, al reducir significativamente el número de pasos de detección y optimización. Un requisito previo para este método son los cristales de proteína o un precipitado cristalino de la proteína diana, obtenido de ensayos de cristalización anteriores.

Protocol

1. Planificación experimental y consideraciones

  1. Utilizar cristales preexistentes de la proteína de interés, preferiblemente generados a través de la cristalización de la difusión de vapor. Para un protocolo generalizado de cristalización de la difusión de vapor, véase Benvenuti y Mangani34. Otros métodos de cristalización, como el microbanda bajo el aceite y la difusión de la interfaz libre, requerirán la cosecha de los cristales antes de triturar para generar microsedas.
  2. En la preparación de un stock de semillas, utilice cristales de la más alta calidad que puedan ser sacrificados. El cristal de la más alta calidad se puede juzgar visualmente en función de la morfología o se puede seleccionar el mejor cristal de difracción, si dichos datos están disponibles. Es muy probable que se obtengan cristales de mejor calidad después de la optimización a través de la siembra. En el caso de que no haya cristales disponibles, se puede utilizar precipitado cristalino como esferulitis y agujas.
  3. Identificar cristales de sal. Los cristales de sal pueden crecer en pantallas de cristalización y pueden parecer cristales de proteínas. El uso de cristales de sal en rMMS no proporcionará ningún beneficio y desperdiciará una muestra preciosa, por lo que es importante eliminar los falsos positivos de sal.
    1. Los cristales de sal son fuertes cuando se trituran. Los cristales deben ser aplastados para generar un stock de semillas, por lo que esta estrategia es particularmente relevante. Si se oye un sonido de grieta audible al aplastar los cristales, es probable que el cristal sea sal.
    2. Si la proteína contiene residuos de triptófano y tirosina, utilice microscopía de fluorescencia ultravioleta para identificar cristales de proteína que fluorescen en estas condiciones de iluminación.
    3. Utilice Izit dye (azul de metileno) para manchar los cristales proteicos y diferenciarlos a cristales de sal que permanecen relativamente sin manchar. Sin embargo, este procedimiento es más destructivo y sólo se recomienda si uno tiene cristales de sobra de réplicas de la misma gota.
      NOTA: Aunque las pruebas antes mencionadas pueden dar resultados prometedores, los cristales de sal todavía pueden confundirse con cristales de proteínas. En este caso, los experimentos de difracción se pueden utilizar para discernir definitivamente entre una proteína y un cristal de sal.

2. Preparación de material de litio I3C

  1. Mida 120 mg de I3C (5-amino-2,4,6-ácido triiodoisoftálico) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Disolver I3C en 200 l de hidróxido de litio de 2 M. La solución se puede calentar suavemente utilizando un bloque de calor a 40-60 oC para fomentar la disolución. La solución de litio I3C resultante debe ser marrón y tiene una concentración de 1 M.
    ADVERTENCIA: El hidróxido de litio es corrosivo. Se deben usar gafas de seguridad, guantes y un abrigo de laboratorio.
  3. Mida el pH de la solución. Si es necesario, añada pequeñas cantidades de ácido clorhídrico de 1 M o hidróxido de litio de 2 M para ajustar el pH a entre 7 y 8. Agregue agua miliaq para que el volumen final de la solución se realice a 400 l. La concentración de la solución de stock I3C es de 0,5 M.
    NOTA: El paso 2.3 es opcional. El pH de la solución debe estar entre pH 7-8 antes de cualquier ajuste del pH. Este paso debe realizarse si la proteína de interés se ve fuertemente afectada por el pH. El protocolo se puede pausar aquí. El litio I3C se puede mantener en la oscuridad a 4 oC durante al menos dos semanas35.

3. Adición de I3C al stock de proteínas

  1. Método 1
    1. Añadir el stock de litio I3C a una alícuota de 150 l de la proteína diana. La concentración final debe estar entre 5-40 mM de litio I3C.
  2. Método 2 (método más suave)
    1. Prepare un tampón de dilución de proteínas que coincida con el tampón de la proteína diana. A este tampón de dilución, agregue el stock de litio I3C para dar una concentración de litio I3C entre 10-80 mM.
    2. Diluir la proteína 1:1 con tampón de dilución de proteínas para dar una concentración final de litio I3C entre 5-40 mM.
      NOTA: Algunas proteínas se precipitan al entrar en contacto con altas concentraciones de litio I3C en el método 1, mientras que otras proteínas pueden tolerarlo. El método 2 reduce la probabilidad de precipitación. Sin embargo, este método reduce a la mitad la concentración de proteínas. Para las proteínas que no tienen un protocolo de cristalización establecido, generalmente se recomienda una concentración de proteínas de 10 mg/ml para el cribado inicial de cristalización. Se recomienda una relación molar inicial de I3C a proteína de 8. La concentración de proteínas y la relación molar de I3C a proteína se pueden optimizar después de la pantalla inicial.

4. Hacer un stock de semillas

  1. Haga una sonda redondeada para triturar cristales.
    1. Con un quemador Bunsen en la llama azul, calienta una pipeta Pasteur hacia su centro. Con una pinza, tire del extremo de la pipeta Pasteur para extraerla en un diámetro delgado inferior a 0,3 mm.
    2. Una vez que la sección media sea lo suficientemente delgada, sostenga ese segmento en la llama para separar la pipeta en este punto y redondee el extremo de la pipeta para terminar la sonda de vidrio.
      NOTA: Las trituradoras de cristal de sonda redondeada son vendidas por proveedores externos. Estas son una alternativa a la fabricación de sondas redondeadas.
  2. Coloque cinco tubos de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo.
  3. Bajo un microscopio de luz, examine la bandeja de cristalización en busca de una condición adecuada para generar microcristales. Idealmente, se seleccionan buenos cristales grandes morfológicos. Sin embargo, esta técnica también funciona con pobres cristales morfológicos, agujas, placas, microcristales y esferulitis.
  4. Abra bien la bandeja de cristalización. Para 96 bandejas de cristalización de pozo selladas con plástico, utilice un bisturí para cortar el plástico que sella el pozo. Para las bandejas colgantes selladas con grasa, el cubreobjetos se puede quitar con pinzas e invertirse en una superficie uniforme.
  5. Transfiera 70 l de solución de depósito a un tubo de microcentrífuga y enfríe sobre hielo. A los otros tubos de microcentrífuga, agregue 90 l de solución de depósito y vuelva al hielo para enfriar.
    NOTA: Si el depósito no tiene suficiente volumen o no existe (en el caso de microbaja bajo aceite), cree un depósito de cristalización mezclando los reactivos adecuados.
  6. Agitar el cristal en la gota usando la sonda de cristal para aplastarlo a fondo. El cristal necesita ser completamente aplastado que puede ser monitoreado bajo el microscopio.
  7. Retire todo el líquido de la gota y transfiéralo al tubo de microcentrífuga con la solución del depósito. Mezclar y posteriormente tomar 2 l de mezcla del tubo de microcentrífuga y añadirlo de nuevo al pozo. Enjuague el pozo con la solución y transfiéralo al tubo de microcentrífuga. Repita este paso de enjuague una vez más. A partir de este momento, mantenga el tubo de microcentrífuga frío para evitar fundir las microsedas en la mezcla.
  8. Vórtice el tubo a la velocidad máxima a 4 oC durante 3 minutos, deteniéndose regularmente para enfriar el tubo sobre hielo para evitar el sobrecalentamiento.
    NOTA: Algunos protocolos de microsedido añaden un cordón de semilla de politetrafluoroetileno al tubo de microcentrífuga para ayudar a la trituración decristales 7,36. Hemos empleado la técnica sin el uso de un cordón de semilla con éxito, pero no vemos problemas con la utilización de un cordón de semilla para aplastar cristales.
  9. Realice una dilución en serie de 1 en 10 del stock de semillas transfiriendo secuencialmente 10 l entre las soluciones de depósito refrigerado.
  10. Almacene las semillas que no se utilizarán inmediatamente a -80 oC.

5. Configuración de una pantalla rMMS

  1. Configuración de una placa de cribado de 96 pozos utilizando un robot dispensador de líquido. En ausencia de un robot, también se puede utilizar una pipeta multicanal.
    1. Transfiera 75 l de un bloque de pozo profundo a una bandeja de cristalización de 96 pozos. Añadir 1 l a la gota de cristalización y 74 l al depósito.
    2. Transferencia de 1 l de proteína suplementada con litio I3C, hecha en el paso 2, a la gota de cristalización.
    3. Transfiera 0,1 ml de stock de semillas a la caída de cristalización.
    4. Selle la placa con cinta adhesiva transparente e incubar la placa a una temperatura constante para permitir el crecimiento del cristal.
  2. Configuración de una pantalla colgante
    1. Engrase los bordes de los pozos colgantes (las bandejas de cristalización colgantes se pueden encontrar en formatos de 24 y 48 pozos).
    2. Transfiera la solución de cristalización de 500 l al depósito.
    3. Cerca del centro de un portaobjetos de cubierta de vidrio, coloque una gota de proteína de 1 l suplementada con litio I3C, hecha en el paso 2.
    4. Añadir 1 l de la solución de cristalización a la gota.
    5. Transfiera 0,1 ml de stock de semillas a la caída de cristalización.
    6. Invierta la corredera de la cubierta y selle bien la cristalización empujando el portaobjetos de la cubierta en la grasa.
    7. Incubar la placa a una temperatura constante para permitir el crecimiento del cristal.
      NOTA: Con las existencias de semillas nuevas y no probadas, se recomienda utilizar el stock de semillas más concentrado para maximizar las posibilidades de obtener golpes de cristalización. Las condiciones posteriores se pueden configurar con una concentración de semillas reducida para optimizar el número de cristales.
  3. Inspeccione las bandejas de cristal bajo un microscopio regularmente para el crecimiento de cristales. Si los cristales son de calidad suficiente, se pueden cosechar para la recolección de datos. Los cristales también se pueden utilizar para generar nuevas existencias de semillas y nuevas pantallas rMMS para permitir la optimización iterativa.

6. Recopilación de datos

  1. Cosecha cristales usando criooloops, crioprotege los cristales y enfría los cristales en nitrógeno líquido. Para obtener información adicional sobre los cristales de refrigeración flash, consulte Teng37 y Garman y Mitchell38.
    1. Durante la etapa de crioprotección, si el cristal se pasa a través de una nueva solución acuosa, I3C se puede perder del cristal debido a que se lee en la solución de crioprotección. Utilice I3C de litio en la solución de crioprotección a una concentración que coincida con la condición de cristalización para mitigar esto.
    2. Los cristales cultivados con este protocolo han sido crioprotegidos con éxito utilizando el crioprotector a base de aceite Parabar 10312 (Hampton Research).
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí mientras los cristales se almacenan en nitrógeno líquido.
      ADVERTENCIA: El nitrógeno líquido puede causar quemaduras por frío. El nitrógeno líquido también puede causar asfixia si se utiliza en espacios cerrados.
  2. Monte el cristal en el goniómetro de la fuente de rayos X y recopile datos de difracción utilizando el protocolo específico para la fuente de rayos X.
  3. Esta técnica se basa en la señal anómala de átomos de yodo en I3C. Por lo tanto, seleccione la energía de los rayos X para maximizar esta señal.
    1. Establezca fuentes de rayos X sincrotrón con energías sintonizables lo más bajas posible. Para muchas líneas de cristalografía macromolecular, la energía configurable más baja es de 8000 a 8500 eV.
    2. Las fuentes de rayos X de ánodo giratorio no se pueden ajustar. Las fuentes de ánodo de uso común con cobre tienen el borde de K a 8046 eV, lo que proporciona una buena señal anómala para el yodo (f" a 6,9 e). Las fuentes de ánodo con cromo tienen un borde de K a 5415 eV, que proporciona una gran señal anómala para el yodo (f" a 12,6 e).
  4. El daño por radiación es un problema importante durante la recopilación de datos, ya que degradará la señal anómala39. Seleccione el tiempo de exposición y la atenuación del haz para lograr la mejor difracción mientras minimiza la dosis de radiación.
    NOTA: En un compuesto de fase similar con los átomos de yodo reemplazados por átomos de bromo, se ha demostrado que el daño por radiación causa la radiolisis del enlace de bromo de carbono y una reducción en la ocupación de los átomos de bromo24.
    1. Utilice la recopilación de datos SAD de haz inverso como estrategia de recopilación. Los datos se recogen en cuñas, con cuñas opuestas recogidas una tras otra. Esto permite que los pares de Friedel se recojan con una dosis equivalente, lo que resulta en una mejor medición de la señal anómala menos afectada por el daño por radiación. Por ejemplo, una estrategia de ocho cuñas para recoger 360o implicaría la recopilación de los datos en el orden de cuña 1 (0o-45o), cuña 2 (180o-225o), cuña 3 (46o-90o), cuña 4 (225o) -270o), cuña 5 (90o-135o), cuña 6 (270o-315o), cuña 7 (135o-180o) y cuña 8 (315o-360o).
      NOTA: La rotación continua es una estrategia de recopilación alternativa a la de la recopilación inversa de datos de vigas. Para una comparación reciente de las estrategias de colección, véase Garcie-Bonte & Katona40.

7. Solución de procesamiento y estructura de datos

  1. Realizar la reducción de datos en los datos de difracción utilizando XDS41,con el objetivo de maximizar la señal anómala. Los parámetros de entrada de reducción de datos son específicos del conjunto de datos y pueden requerir algún ensayo y error. Estas son algunas recomendaciones para empezar.
    1. Establezca LA LEY DE FRIEDEL-FALSE. Ejecute CORRECT dos veces, estableciendo STRICT_ABSORPTION_CORRECT - TRUE y STRICT_ABSORPTION_CORRECT - FALSE. Una ejecución puede tener una señal anómala más alta que la otra. Compare las señales anómalas entre las corridas utilizando las disciplinas 'Anomal Corr' y 'SigAno' en la salida. Esto proporciona un indicador de la calidad de los datos.
    2. Ejecute SHELXC en el XDS_ASCII. HKL para una indicación más precisa de la señal anómala. La disciplina 'Ranom' dará una indicación de la señal anómala en diferentes resoluciones.
  2. Ejecute POINTLESS42 y AIMLESS43 para escalar los datos. En AIMLESS, establezca el parámetro ANOMALOUS ON. Si se utiliza el GUI, seleccione la opción Separar pares anómalos para el rechazo de valores atípicos y las estadísticas de fusión. Es posible que se requieran pruebas de diferentes cortes de resolución para maximizar la señal anómala.
  3. Resuelva la estructura proteica utilizando auto-Rickshaw automatizado de la estructura de cristal pipeline44. Auto-Rickshaw intentará resolver el problema de fase y construir la estructura cristalina de la proteína automáticamente con el modelado de proteínas y el software de refinamiento.
    1. Para proteínas sin una plantilla de modelo de homología, ejecute el protocolo SAD de Auto-Rickshaw en modo avanzado. Introduzca los parámetros necesarios.
      1. Seleccione PROTEINa como el tipo de molécula.
      2. Ingrese la longitud de onda de la recopilación de datos en angstroms (o).
      3. Seleccione "I" como elemento de subestructura para indicar que se utilizaron átomos de yodo.
      4. Seleccione "i3c" como tipo de subestructura para indicar que I3C era la molécula de fase.
      5. Seleccione "sub_direct" como método de determinación de subestructuras. Este método emplea SHELXD32 para buscar la subestructura.
      6. Seleccione "3" como el número de subestructura esperada por monómero.
      7. Escriba "1" como límite de resolución de la búsqueda de subestructuras. Esto permite que Auto-Rickshaw determine automáticamente un límite de resolución adecuado.
      8. Introduzca el número de residuos en un solo monómero, grupo espacial del conjunto de datos y número de moléculas en la unidad asimétrica en función del coeficiente Matthews.
      9. Seleccione el nivel de difusión adecuado de los datos de rayos X que se adapte a las necesidades. Si selecciona "Desarrolladores de AutoRickshaw", los desarrolladores de Auto-Rickshaw podrán solucionar los problemas de ejecución si surgen problemas.
      10. Introduzca los datos anómalos como un archivo mtz.
      11. Introduzca la secuencia de proteínas como un archivo seq, pir o txt. Un archivo seq se puede generar en un editor de texto (como Notepad++9 en Windows o nano en Linux). Cree un nuevo archivo, introduzca la secuencia principal de la proteína como una línea larga o separada por saltos de línea. Guarde el archivo con la extensión de archivo .seq.
      12. Introduzca una dirección de correo electrónico institucional.
  4. Los resultados se entregan a través de un enlace web enviado a la dirección de correo electrónico proporcionada.
    NOTA: AutoRickshaw es una canalización automatizada que invoca varios paquetes de software de cristalografía para resolver una estructura de cristal de rayos X32,33,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58. Si la ejecución de Auto-Rickshaw no resuelve la estructura, se pueden probar otros ajustes de Auto-Rickshaw. El método de determinación de estructura se puede cambiar a "sub_phassade" para utilizar Phaser59 en lugar de SHELXD32. El número de subestructuras esperadas por monómero también puede aumentarse o disminuirse.
  5. Durante la fase experimental de la estructura cristalina, Auto-Rickshaw intentará posicionar átomos pesados en la célula de la unidad, creando una subestructura. La disposición del triángulo equilátero de los átomos de yodo en I3C presenta una forma eficiente de validar la subestructura. Si se produce un error en el paso 6.3, la validación de la subestructura podría ayudar a solucionar problemas de solución de la estructura.
    1. Descargue la lista de sitios de átomos pesados desde la página de resultados de Auto-Rickshaw. Es un hipervínculo llamado "sitios de átomos pesados". Esto descargará un archivo de texto con los sitios de átomos pesados.
    2. Cambie la extensión de archivo del archivo de .txt a .pdb.
    3. Abra el archivo PDB en Coot60. Active la simetría para ver otros átomos pesados de unidades asimétricas vecinas.
    4. Mida las distancias entre los átomos pesados, incluso a través de unidades asimétricas. I3C aparecerá como un triángulo equilátero con una longitud lateral de 6 angstroms. La presencia de un triángulo con estas dimensiones indica que las ubicaciones de esos átomos pesados son correctas.

Representative Results

La incorporación de I3C en rMMS puede generar nuevas condiciones que apoyen el crecimiento de cristales derivados
La eficacia del cribado simultáneo de RMMS y la derivación de I3C se demostró en dos proteínas, la lysozyme de clara de huevo de gallina (HEWL, obtenida como polvo liofilizado) y el dominio putative Orf11 de lisina N-terminal (Orf11 NTD) de la bacteria P68. Cada proteína fue examinada contra PEG/ION HT en cuatro condiciones diferentes, incluyendo: sin semillas, sembrada, sin sembrar con I3C y sembrada con I3C (Figura 1). Para ambas proteínas, la única adición de I3C no aumentó el número de condiciones propicias para la cristalización. En el caso de Orf11 NTD, sólo se identificó una condición adecuada con y sin I3C (Figura 1B). Cuando se añadió I3C a las pantallas HEWL, el número de aciertos se redujo de 31 a 26, destacando las complejidades añadidas de la cristalización al introducir compuestos de fase (Figura 1A). De acuerdo con otros estudios, la adición de semillas a las pantallas de matriz dispersa comercial para generar una pantalla rMMS aumentó significativamente el número de posibles condiciones de cristalización para ambas proteínas, lo que resultó en un aumento de 2.1 y 6 veces para HEWL y Orf11 NTD, respectivamente6,61 ( Figura1). Lo más importante es que la adición simultánea de I3C y la semilla aumentó el número de visitas en relación con una pantalla no sembrada, lo que demuestra un aumento de 2,3 y 7 veces para HEWL y Orf11 NTD, respectivamente. Muchos de los cristales de rMMS en presencia de I3C muestran una excelente morfología cristalina(Figura 2).

La siembra permite un control cuidadoso del número de cristal en las pantallas I3C rMMS
En experimentos de microsedas, el número de semillas introducidas en un ensayo de cristalización se puede controlar mediante la dilución del stock de semillas y esto permite un control preciso de la nucleación en la gota7,36. Esto a menudo permite que se formen cristales más grandes ya que se reduce la competencia de moléculas de proteína en los sitios de nucleación. Esta ventaja también se extiende al método I3C-rMMS y se ha demostrado con éxito en HEWL y Orf11 NTD. La recreación de una condición de cristalización identificada desde la pantalla I3C-rMMS con un stock de semillas diluida produjo menos cristales pero más grandes(Figura 3).

Sad fasesing se puede utilizar para resolver las estructuras de cristales derivados de la pantalla rMMS I3C
Los cristales cultivados con el stock de semillas diluidas que se muestra en la Figura 3 se utilizaron para resolver la estructura de las proteínas utilizando la fase SAD utilizando datos de difracción de un solo cristal (Figura 4). Los datos fueron recogidos en la línea de haz Australian Synchrotron MX162. Los detalles detallados de la recopilación de datos y la solución de estructura se describen en otros lugares27.

Figure 1
Figura 1 - rMMS se utilizó para generar nuevas condiciones para el crecimiento de cristal en presencia de I3C para dos proteínas de prueba. 96 pantallas de cristalización de difusión de vapor de pozos se llevaron a cabo utilizando pantallas de matriz dispersa comercial. (A) La lysozyme de la clara de huevo de gallina se probó con la pantalla del índice HT. Las bandejas se sembraron con cristales HEWL cultivados en tartrato de amonio de 0,2 M dibásico pH 7,0, 20% (p/v) polietilenglicol 3350. (B) Orf11 NTD de bacteriófago P68 se probó con la pantalla PEG/ION. Las bandejas NTD orf11 se sembraron de cristales de la condición G12 de la pantalla sin sembrar, mostrada en azul. Las condiciones que apoyan el crecimiento del cristal se muestran en rojo. La siembra de rMMS en presencia y ausencia de I3C dio significativamente más impactos de cristal que las bandejas sin semillas. Figura adaptada de Truong et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 - Imágenes representativas de cristales cultivados a partir de los ensayos de difusión de vapor que se muestran en la Figura 1 a) y b). Figura adaptada de Truong et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 - La dilución del stock de semillas es una manera eficaz de reducir la nucleación en una condición de cristalización que se encuentra utilizando el método I3C-rMMS, para controlar el número de cristales que se forman. La reducción de la nucleación dentro de una gota a menudo da como resultado que los cristales crezcan a dimensiones más grandes. Figura adaptada de Truong et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) y HEWL (PDB ID 6PBB) se cristalizaron utilizando el método I3C-rMMS y se resolvieron mediante la fase de Auto-Rickshaw SAD. (A) Estructuras de cinta de HEWL y Orf11 NTD resueltos a través de la fase experimental. (B) Molécula I3C enlazada a HEWL y Orf11 NTD. (C) Los átomos de yodo anómalos en I3C están dispuestos en un triángulo equilátero de 6o. Por lo tanto, la presencia de este triángulo en la subestructura de fase indica que hay una molécula de I3C en esa posición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La determinación de la estructura de una proteína novedosa en ausencia de un modelo de homología adecuado para el reemplazo molecular requiere una fase experimental. Estos métodos requieren la incorporación de átomos pesados en el cristal proteico que añade un nivel de complejidad a la tubería de determinación de la estructura y puede introducir numerosos obstáculos que deben ser abordados. Los átomos pesados se pueden incorporar directamente en la proteína a través de la expresión etiquetada utilizando selenomethionina y selenocisteína. Como este método es costoso, laborioso y puede resultar en menores rendimientos proteicos, la proteína etiquetada a menudo se expresa después de que se han encontrado condiciones de cristalización y se ha optimizado con proteínas sin etiquetar. Alternativamente, los cristales pueden ser derivados empapando en una solución que contiene átomos pesados22,63,64. Este método a menudo utiliza cristales de alta calidad y por lo tanto se realiza después de que ya se ha desarrollado un método de cristalización robusto. Obtener con éxito un cristal derivado utilizando este método requiere una mayor optimización de los procedimientos de remojo y el cribado de diferentes compuestos de fase, añadiendo así más tiempo a un proceso ya laborioso.

La co-cristalización de la proteína con el átomo pesado se puede realizar en la etapa de cribado, agilizando así eficientemente el proceso y reduciendo los pasos de manipulación de cristales que pueden causar daños. Sin embargo, todavía existe el escenario potencial de obtener pocos impactos iniciales de cristalización y el problema de elegir un compuesto de átomo pesado compatible. Muchos compuestos de fase disponibles actualmente son incompatibles con precipitantes, tampones y aditivos que se encuentran comúnmente en condiciones de cristalización. Pueden ser insolubles en tampones de sulfato y fosfato, quelato al citrato y acetato, reaccionar desfavorablemente con los amortiguadores HEPES y Tris o ser secuestrados por la TDT y β-mercaptoetanol21. Como el compuesto de fase I3C no sufre de estas incompatibilidades, es un compuesto de fase robusta que podría ser susceptible a muchas condiciones diferentes.

En este estudio, se presenta un método simplificado de producción de cristales derivados listos para la fase SAD a través de la co-cristalización simultánea del compuesto de fase I3C y rMMS. La combinación de ambas técnicas aumenta el número de golpes de cristalización, con muchas de las condiciones que han mejorado la morfología y las características de difracción. En los casos de prueba Orf11 NTD y HEWL, se identificaron nuevas condiciones en la pantalla I3C-rMMS que estaban ausentes cuando I3C no estaba presente. Potencialmente, I3C puede unirse favorablemente a la proteína, facilitando la formación y estabilización de contactos de cristal27. A su vez, esto puede inducir cristalización y posiblemente mejorar las características de difracción. Además de ser un compuesto compatible con pantallas de matriz dispersas, I3C es también un atractivo compuesto de fase debido a sus propiedades intrínsecas. Los grupos funcionales que se alternan con el yodo en el andamio del anillo aromático permiten una unión específica a las proteínas. Esto conduce a una mayor ocupación y potencialmente reduce la señal de fondo23. Además, la disposición de dispersores anómalos en un triángulo equilátero es evidente en la subestructura y se puede utilizar para validar rápidamente la unión de I3C(Figura 4B y 4C). Por último, puede producir una señal anómala con radiación sincrotrón sintonizable, así como fuentes de rayos X de ánodo giratorio de cromo y cobre. Por lo tanto, se puede aplicar a muchos flujos de trabajo diferentes. Como I3C está ampliamente disponible y es barato de comprar, este enfoque está al alcance de la mayoría de los laboratorios de biología estructural.

Hay varias consideraciones experimentales que deben abordarse cuando se utiliza el método I3C-rMMS. Este método no se puede aplicar si no se puede obtener material cristalino inicial de la proteína. En casos difíciles, el material cristalino de una proteína homóloga también se puede utilizar para generar stock de semillas. Este enfoque de la siembra cruzada de rMMS ha mostrado algunos resultados prometedores7. Optimizar el número de cristal a través de la dilución del stock de semillas es un paso crucial, que no debe pasarse por alto, para maximizar la posibilidad de producir cristales grandes de alta calidad y adquirir datos de difracción adecuados. Si hay pocos sitios I3C identificados en la unidad asimétrica, las condiciones propicias para la cristalización deben optimizarse aún más con una mayor concentración de I3C. Esto puede aumentar la ocupación de I3C para maximizar la señal anómala y ayudar a la derivación de cristal.

Puede haber casos en los que esta técnica puede no ser el método óptimo para derivar cristales proteicos. A medida que aumenta el tamaño de una proteína o complejo proteico, el número limitado de sitios I3C en la superficie de la proteína puede no proporcionar suficiente potencia de fase para resolver la estructura. En estos escenarios en los que se sospecha que el tamaño de las proteínas está impidiendo la fase, el etiquetado de la proteína puede ser un enfoque más viable para la eliminación gradual de la proteína. Si la proteína tiene un número adecuado de residuos de metionina en la proteína (recomendado tener al menos una metionina por cada 100 residuos65)y se puede lograr la incorporación de selenomethionina de alta eficiencia en una proteína (como en los sistemas de expresión bacteriana66), múltiples átomos de selenio de alta ocupación estarán presentes en los cristales para fase de la estructura.

Además, algunas proteínas pueden intrínsecamente no ser adecuadas para la derivación con I3C. Los sitios de unión I3C a proteínas dependen de la estructura proteica. Puede haber proteínas que naturalmente tienen pocos parches expuestos compatibles con la unión I3C. Por lo tanto, no es imprevisible que pueda haber dificultades para co-cristalizar algunas proteínas diana con I3C.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación se llevó a cabo en la línea de haz MX1 en el Sincrotrón Australiano, parte de ANSTO. Los autores desean reconocer a los miembros de los laboratorios Shearwin y Bruning para los debates sobre este trabajo. Los autores también quieren reconocer a la Dra. Santosh Panjikar y a la Dra. Linda Whyatt-Shearwin que contribuyeron a la obra original que fue pionera en este protocolo.

Se reconoce la siguiente financiación: Consejo Australiano de Investigación (concesión Nos. DP150103009 y DP160101450 a Keith E. Shearwin); Universidad de Adelaida (Beca de estipendio del Programa de Entrenamiento de Investigación del Gobierno Australiano para Jia Quyen Truong y Stephanie Nguyen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL disposable luer lock syringes Adelab Scientific T3SS10LAT Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells
24 well tissue culture plate Sigma Aldrich CLS3527 Used for hanging drop crystal tray
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506 For 96 well crystallization screens set up by robot
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid Alfa Aesar B22178 Commonly referred to as I3C in the article
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original Hampton Research HR3-297 For 96 well crystallization screens set up by robot
Coverslips  Thermo Fisher Scientific 18X18-2 Coverslips for hanging drop crystal tray wells
Dow Corning vacuum grease Hampton Research HR3-510 Used for sealing hanging drop crystal tray wells
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL Eppendorf 3120000011
Gilson Pipette 2 μL-20 μL John Morris Group 1153247
Gilson Pipette 20 μL-200 μL John Morris Group 1152006
Glass pasteur pipettes Adelab Scientific HIR92601.01
Hen Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Approximately 95% pure
IndexHT screen Hampton Research HR2-134
Microscope illuminator Meiji Techno FT192/230 Light source to illuminate crystallography experiments
PEG/ION HT screen Hampton Research HR2-139
Phoenix Liquid Dispenser Art Robbins Instruments 602-0001-10
Scalpel with scalpel blade no. 15 Adelab Scientific LV-SMSCPO15
Seed bead kit Hampton Research HR2-320 Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.
Stereo microscope  Meiji Techno EMZ-5TR Microscope for visualising crystallography experiments
Tweezers Sigma-Aldrich T5415
Vortex mixer Adelab Scientific RAVM1

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Derivatización de cristales proteicos con I3C mediante el cribado de matriz de microsemalla aleatoria
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