Summary
I denne publikation beskriver vi protokoller til vurdering af luftvejes mucociliary clearance (MCC) hos mus in vivo ved hjælp af dual-modality radionuclide imaging. Denne protokol er designet til en enkelt foton emission computertomografi (SPECT) og computertomografi (CT) erhvervelse protokol ved hjælp af musen hele kroppen (MWB) collimators i en dobbelt SPECT / CT-system.
Abstract
Respiratorisk motile cilia, specialiserede organeller i cellen, linje den apikale overflade epitelceller foring luftvejene. Ved at slå i en metakronal, synkronal måde, disse mange, motile, actin-baserede organeller generere en cephalad væske flow rydde luftvejene af inhalerede forurenende stoffer og patogener. Med stigende miljøforurening, nye viruspatogener og nye multiresistente bakterier er cilia-genereret slimhinderydning (MCC) afgørende for at opretholde lungesundheden. MCC er også deprimeret i flere medfødte lidelser som primær ciliary dyskinesi, cystisk fibrose samt erhvervet lidelser som kronisk obstruktiv lungesygdom. Alle disse lidelser har etableret, i nogle tilfælde flere, musemodeller. I denne publikation beskriver vi en metode, der bruger en lille mængde radioaktivitet og dual-modality SPECT/CT-billeddannelse til nøjagtigt og reproducerbart at måle MCC hos mus in vivo. Metoden giver mulighed for genvinding af mus efter billeddannelse, hvilket gør seriemålinger mulige og tester potentielle terapeutiske langsgående over tid. Dataene i mus af vild type viser reproducerbarheden af MCC-målingen, så længe der lægges tilstrækkelig vægt på detaljer, og protokollen overholdes nøje.
Introduction
Cilia er mikrotubule baserede cellulære organeller bevaret på tværs af evolutionære historie fra alger til mennesker. De stammer fra celleoverflader og har en række funktioner1, lige fra anerkendelse af lokale miljømæssige sensoriske signaler til motilitet, funktioner, der kan spores tilbage fra mennesker til tidlige encellede eukaryote organismer2,3. Cilia kan være ikke-motil og enkelt tjener som en celles specialiserede antenne til at behandle miljøsignaler; eller motile og flere, slå i synkroniserede, metakronal bølger til at generere væske flow, såsom i foring af æggelederne og de øvre og nedre luftveje, bortset fra terminalen bronchioles fører til alveoler1,2.
Luftvejenes omfattende epiteloverflade udsættes for en konstant spærreild af forurening i form af en række potentielt farlige inhalerede forurenende stoffer og patogener, hvilket kræver et forsvar. En vigtig forsvarsmekanisme er tracheobronchialtræets slimapparat, hvor en kontinuerlig strøm af udskillet slim mekanisk transporteres ud af luftvejene ved at slå flere motile cilia, der forer de apikale overflader af tracheo-bronkial epitelcellerne. Disse funktion til at fange inhalerede forurenende stoffer, og gennem deres kontinuerlige, synkronale slå, transportere dem cephalad4,5.
Cilia har vist sig at have nøgleroller som i udviklingen af venstre-højre mønstre i udviklingen af embryoner, hvor motile cilia på embryonale node bryde symmetri6. Mutationer i cilia-relaterede gener er blevet knyttet til sygdomme som medfødt hjertesygdom (CHD) på grund af hjertets asymmetriske struktur6. Nylige undersøgelser har rapporteret en høj forekomst af ciliary dysfunktion i luftvejene hos patienter med CHD, samt en øget forekomst af postoperative luftvejskomplikationer og kroniske luftvejssymptomer i øvre og nedre luftveje7,8,9,10. Patienter med CHD og ciliary dysfunktion, med eller uden heterotaxy, har vist sig at have øget risiko for luftvejskomplikationer og negative åndedrætsresultater postoperativt5,8,10. Ud over deres roller i signalering og udvikling, er betydningen af luftveje cilia blevet demonstreret af ciliopatier, hvoraf et godt eksempel er primær ciliary dyskinesi (PCD). PCD er en medfødt lidelse som følge af en række mutationer, der påvirker den bevægelige respiratoriske cilia, hvilket fører til tilbagevendende lungeinfektioner, bronchiectasis og potentielt behovet for lungetransplantation11. Derudover, selv om cilia er normale i cystisk fibrose (CF), mest almindelige medfødte lidelse i den kaukasiske befolkning, MCC er nedsat på grund af tyk, tyktflydende slim som følge af mutationer i CFTR genet12. Der er flere musemodeller af PCD og CF samt et stadigt stigende antal modeller af CHD. I sidste ende cilia er alsidige strukturer med mange nøgleroller, og en metode til at vurdere funktionen af motile respiratoriske cilia in vivo kan være værdifulde for præklinisk undersøgelse, og vurdere virkningerne af mutationer samt lægemidler på slimhinde clearance (MCC)13. Metoden vil også være værdifuld i vurderingen af virkningerne af nye lægemidler, genterapi eller interventioner på MCC i disse musemodeller.
Der er mange forskellige modeller, der er blevet brugt til at vurdere MCC. En bemærkelsesværdig metode indebærer brug af methylenblåt farvestof, der er blevet indpodet i bronchus, med clearance målt ved fiberoptisk måling af farvestofbevægelse14. Denne metode er begrænset af evnen til at observere farvestoffets bevægelse, hvilket er mere rutine hos mennesker end i prækliniske musemodeller. En anden bemærkelsesværdig metode er synkrotronfasekontrast røntgenbilleder (PCXI), som kan bruges til at spore individuelle partikler i en luftvej. Denne metode er forholdsvis ny og ikke almindeligt tilgængelig15. Der findes talrige ex vivo-metoder til vurdering af luftvejene ved at udskille en luftrør til videomikroskopi, men disse modeller giver kun ringe nytteværdi hos humane patienter16. Højopløsningsteknikker til ciliabilleddannelse, såsom optisk sammenhængstomografi, er begrænset på samme mådesom 17.
I denne artikel præsenterer vi en reproducerbar metode til måling af MCC in vivo, der er blevet brugt til at måle lungefrigange i utallige dyremodeller, samt undersøgelse MCC i kronisk obstruktiv lungesygdom og vurdere virkningerne af immunosuppressive lægemidler18,19. Denne metode sporer frihøjden af den radioaktive 99mtechnetium-svovl colloid (99mTc-Sc), en uopløselig partikelradiotracer, efter instillation i lungerne. Radionuklidet kan derefter spores ved hjælp af enkelt foton emission computertomografi (SPECT)18,20. Vi har yderligere raffineret denne teknik til måling af MCC ved hjælp af dobbelt modalitet SPECT og computertomografi (CT) billeddannelse med co-lokalisering af radioisotop tæller til lungerne og måle faldet i disse tæller over 6 timer. Dual-modality imaging, med co-registrering af CT og SPECT billeder giver mulighed for nøjagtig lokalisering af stråling tæller til vores region af interesse, lungerne. Selvom vi detaljeret beskriver metoden til MCC-måling hos mus, kan protokollen justeres for at studere MCC hos rotter. Collimatorerne skal justeres såvel som strålingsdosis. Efter vores mening er mus MCC-scanninger mere teknisk udfordrende på grund af den lille dyrestørrelse, men mere nyttige end rotter på grund af det store antal etablerede musemodeller af en række menneskelige lidelser. På grund af deres lavere omkostninger og vedligeholdelsesomkostninger i dyrekolonier er en større prøvestørrelse mere mulig hos mus.
Protocol
University of Pittsburgh's Institutional Animal Care and Use Committee godkendte alle de dyreprotokoller, der er specificeret i denne publikation, inden de udførte nogen af disse dyreforsøg.
BEMÆRK: Denne protokol beskriver, hvordan man udfører in vivo mucociliary clearance undersøgelser ved hjælp af radionuklid imaging med en dual-modality SPECT / CT scanner. De demonstrerede teknikker kører systemkalibreringer, bedøvende mus, tracheal intubation af mus, indgyde isotop i lungerne, dobbelt-modalitet billeddannelse, co-registrering af disse billeder, og analyse.
1. Opsætning af SPECT/CT-system
- Design en passende arbejdsgang, og konfigurer den, inden du kører forsøg med levende dyr.
- Brug en SPECT-anskaffelse bestående af 60 fremskrivninger med en trinstørrelse på 6o mellem fremskrivninger med en rotationsradius på 40 cm. CT-overtagelsen består af 220 fremskrivninger med en vinkel på 1,6o mellem fremskrivningerne.
- Sørg for, at systemet har de korrekte MWB-kollimatorer til mus og SPECT-billeddannelse på plads. Hvis de uhensigtsmæssige collimatorer er installeret, skal du bruge guiden Collimator til at installere de rigtige.
- Kør de nødvendige systemkalibreringer for at forberede systemet til brug.
BEMÆRK: SPECT- og CT-komponenterne i scanneren skal kalibreres. Kalibrere CT-komponenterne ved hjælp af en kildekonditionering og en D/L-kalibrering (Dark/Light) en gang om dagen, en COS-kalibrering (Center Offset) hver anden uge og evaluere røntgenhardwaren hver måned. SPECT-komponenterne skal kalibreres en gang om året.- Hvis du vil evaluere røntgenhardwaren, skal du markere feltet Evaluer røntgenhardware under CT-kalibreringer(Supplerende CT-kalibreringsmenu).
- Hvis du vil udføre kildekonditionering, skal du markere feltet Udfør kildekonditionering under CT-kalibreringer(Supplerende CT-kalibreringsmenu).
- Hvis du vil udføre en D/L-kalibrering, skal du markere D/L-boksen ud for den CT-anskaffelsesprotokol, der bruges under forsøg under CT-kalibreringer. Fjern markeringen af alle andre protokoller(supplerende CT-kalibreringsmenu).
- Hvis du vil udføre en COS-kalibrering, skal du udskifte sengen med kalibreringsringværktøjet, justere indstillingerne for sengetype, så de passer til indstillingerne for bevægelseskontrol, og markere COS-boksen ud for den CT-anskaffelsesprotokol, der blev brugt under forsøg under CT-kalibreringer. Fjern markeringen af alle andre protokoller(supplerende CT-kalibreringsmenu, supplerende kalibreringsring).
2. Mus intubation og instillation
- Afvej de mus, der skal scannes. Hvis du scanner flere mus, skal du sørge for at markere musene til identifikationsformål ved hjælp af metoder som ørestansning eller markering af halen.
- Bedøve en mus ved hjælp af 1,5% isoflurane med en gasstrøm på 2 L/min O2 i en gas kammer i ~ 5 minutter til at producere anæstesi af tilstrækkelig dybde, indtil vejrtrækningen bremser til ~ 55-65 vejrtrækninger per minut 16 (Figur 1A).
- Fjern musen fra kammeret og ophæng ved de forreste snit på en intubationsstand ved en 45o hældning. Udstyr intubationsstanden med en næsekegler for at sikre, at musen bedøves under intubationen (Figur 1B).
- Tilslut den ene ende af en 50 μm fiberoptisk ledning til en lyskilde og tråd en 20-gauge kanyle over det ved hjælp af ledningen til at fungere som en guide(Figur 1C).
- Åbn musens mund og træk tungen fremad ved hjælp af stumpe pincet. Belys styretråden, og brug den til at visualisere stemmebåndene (Figur 1D).
- Pass guide wire gennem stemmebåndene, så ledningen er lige uden for stemmebåndene og hviler i den øverste luftrør. Skub 1 tommer kanylen frem langs ledningen for at intubere musen og passere kanylen dybt nok, så navet er mod dyrets fortænder (Figur 1E). Fjern ledningen og lad kanylen være på plads.
- Test intubationen ved kortvarigt at tilslutte kanylen med en finger og kontrollere, om vejrtrækningen ændres. Standset vejrtrækning eller anstrengt vejrtrækning, mens du tilslutter og accelereret vejrtrækning ved frigivelse er tegn på korrekt tracheal intubation. Hvis der ikke er nogen ændring i åndedrætsmønstrene ved tilslutning af kanylen, er sidstnævnte sandsynligvis i spiserøret.
- Forbered 0,2 mCi af 99mtechnetium-svovl colloid(99mTc-Sc) i et volumen på 10 μL, og pipette ind i kanylen. Lad musen spontant indånde det i lungerne over 1-2 min (Figur 1F). Fjern kanylen, før du overfører musen til scannerens palle.
BEMÆRK: Radionuklidet blev forberedt og filtreret af Cardinal Health.
3. SPECT/CT Imaging
- Overfør musen til en 25 mm palle med en næsekegler og fastgør med tape, og pas på ikke at tape brystet og maven for tæt for at undgå at forringe åndedrættet. Pas på at fjerne metaløremærker, der er fastgjort til musen.
- Forbered et radioaktivt fantom bestående af 0,05 mCi i 200 μL og læg dette beløb i et 0,2 mL PCR-rør. Placer røret ved at tape til pallen under musens underliv og undgå overlapning med lungerne.
BEMÆRK: Fantomet bruges til at sammenregistrere CT- og SPECT-billeder samt til negativ kontrol til rydning. - Indsæt musen i SPECT/CT-systemet, vælg billedarbejdsgangen, og kør installationsprogrammet.
- Konfigurer placeringen af detektorerne på musen, og kør billedarbejdsgangen.
- Forbered et bur til mus, der har modtaget radioaktivitet efter proceduren, med ubegrænset adgang til mad og vand og klar mærkning ved hjælp af et strålingssikkerhedsklistermærke.
- Når arbejdsprocessen er afsluttet, skal du fjerne musen fra billedpallen og lade den komme sig i det forberedte bur i en periode på 6 timer mellem scanningerne (afslutningen af scanning 1 til begyndelsen af scanning 2) med ad libitum adgang til mad og vand. 6 timer blev valgt, da det svarer til den periode, hvor lineær frihøjde afhængigt af cilia-funktionen finder sted med meget lidt alveolar clearance.
- Efter 6 timer bedøves musen igen, og der scannes sammen med fantomet ved hjælp af den samme arbejdsgang til måling af mængden af isotop, der er fjernet fra luftvejene.
BEMÆRK: Det er afgørende at lade musen komme sig som uafbrudt anæstesi med isofluran i 6 timer vil føre til en betydelig cilia-depressiv effekt, hvilket resulterer i næsten nul slimhindefrigange.
4. Analyse
- Efter billedbehandling skal du udføre efterbehandling for at rekonstruere komplette 3D-stakbilleder.
- Histogram SPECT billeder ved hjælp af fabrikken standardindstillinger for 99mTc, og derefter rekonstruere ved hjælp af en MAP3D algoritme og punkt spredning funktion (PSF) genopbygning.
BEMÆRK: Rekonstruktionen blev udført ved hjælp af 8 gentagelser og 6 delsæt. En effektiv rekonstruktion har brug for et forhold mellem delmængder og fremskrivninger kl. 1:10 eller fordeler jævnt i antallet af fremskrivninger, så 6 delmængder blev brugt på grund af erhvervelsen ved hjælp af 60 fremskrivninger. - Rekonstruer CT-billederne ved hjælp af Feldkamp-algoritmen og et Shepp-Logan-filter.
BEMÆRK: Rekonstruktionen blev udført ved hjælp af 4 gentagelser.
- Histogram SPECT billeder ved hjælp af fabrikken standardindstillinger for 99mTc, og derefter rekonstruere ved hjælp af en MAP3D algoritme og punkt spredning funktion (PSF) genopbygning.
- Behandl CT- og SPECT-billederne i FIJI ImageJ21 ved hjælp af relikvieværktøjet til at generere koronarvisningsbilleder fra standardaksialbillederne. Udfør derefter en z-stack-sumprojektion på SPECT-billedet for at tilføje tælledataene fra hvert udsnit og generere et enkelt billede for at gøre det nemmere at analysere.
- Tilpas størrelsen på og sammenregistrer CT- og SPECT-billederne ved hjælp af fantomet Eppendorf-røret som reference (Figur 2A,B). Spor og brug ensartede størrelsesmålinger på tværs af alle prøver.
- Binarize CT-billedet ved hjælp af automatisk tærskel, efterfulgt af at vende stakken, og udfører en z-stack sum projektion til at generere en skitse af lungerne til analyse (Figur 2C).
- Roter CT- og SPECT-billederne, og flet billedet ved hjælp af kanalværktøjerne. Beregn MCC ved at tegne et investeringsafkast rundt om højre lunge og måle (Figur 2D).
BEMÆRK: Denne måling vil være af det samlede antal i højre lunge for 0- og 6-timers tidspunkterne, hvor 6-timers billederne korrigeres for radioaktivt henfald ved hjælp af formlen: N(t) = N0e−t. 99 m Tc-Sc har en henfaldskonstant på 3,21e−5 pr. sekund med en halveringstid på ~6 timer. Disse værdier kan derefter bruges til at beregne en procentafstand.
BEMÆRK: Højre lunge vælges til ROI-tegning og måletal, da slimhindeafstanden vil transportere radioisotopen ud af lungerne til svælget, hvorfra den vil blive slugt og ende i maven. Ganske ofte kan tæller ses i maven, der kan overlappe med venstre lunge og dermed producere fejlagtige tæller. Denne forvirrende kan undgås ved at måle tæller i højre lunge alene.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol bedøvede vi mus i et isoflurankammer (Figur 1A). Efter at have opnået et tilstrækkeligt niveau af anæstesi blev mus placeret på lodrette understøtninger (Figur 1B), og stemmebåndene blev visualiseret ved hjælp af en belyst føringstråd (Figur 1C-1D). Musene blev intuberet og indpodet med 0,2 mCi 99mTc-Sc i mængder på 10 μL gennem en kanyle og mus lov til spontant at indånde i lungerne (Figur 1E-1F). Efter billederhvervelse og -behandling blev CT- og SPECT-billederne kolocaliseret (Figur 2A) ved hjælp af fantomrøret som et vartegn (Figur 2B). Lungernes masker blev genereret fra CT-billedet (Figur 2C) og brugt til at tegne ROI'er rundt om højre lunge til analyse ved 0 (Figur 2D) og 6 timer (Figur 2E-2F). For at teste protokollens reproducerbarhed blev i alt 8 mus scannet to gange på forskellige dage med identiske forsøgsbetingelser, og analysen ved hjælp af en parret t-test viste ingen signifikant forskel mellem de gentagne scanninger (p-værdi=0,9904) (Figur 3A). Yderligere 2 mus blev scannet tre gange på forskellige dage med identiske forsøgsbetingelser, hvor analyser ved hjælp af envejs-ANOVA viste signifikant matchning mellem gentagelsesscanningerne (p-værdi på 0,0041) (Figur 3B). I alt 8 mus blev scannet, og der blev vist to repræsentative billeder (figur 4).
Figur 1: Mus intubation og isotop instillation. Billeder af de trin, der er nødvendige for at intubere og indgyde isotop i luftvejene. A)Musen bedøves i et kammer. B)Den bedøvede mus er placeret på en lodret støtte, suspenderet af de forreste fortænder. C)En oplyst 0,5 mm fiberoptisk ledning, der tjener som styretråd, fremstilles ved at køre den gennem en 20 G kanyle. D) Musens mund åbnes ved hjælp af tang og belyses ved hjælp af den tændte guidewire til at visualisere stemmebåndene. E)Kanylen skubbes hen over stemmebåndene, og guidewiren fjernes. F) Opløselig isotop indpodes i kanylen ved hjælp af en pipette, og musen får lov til spontant at indånde isotopen i lungerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: SPECT/CT-billeder af en MCC-scanning. A) Et SPECT-billede, der er blevet lokaliseret i samarbejde med et CT-billede. B) Et CT-billede med et synligt fantomrør, der blev brugt til samlokalisering. C) En maske af luftvejene afledt ved binarizing CT billedet og udfører en z-stack sum projektion. D) CT-masken er sammen lokaliseret med SPECT-billedet. En ROI til analyse er blevet trukket rundt om højre lunge. E)En maske af luftvejene på 6 timer. F)En CT og SPECT co-lokaliseret billede af luftvejene på 6 timer med en ROI til analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Rydningsmålinger af de samme mus på tværs af flere scanninger. A)To individuelle gentagelsesafstande blev målt for 8 mus uden ændringer i forsøgsbetingelserne. En parret t-test viste, at der ikke var nogen signifikant forskel mellem de gentagne scanninger med en p-værdi på 0,9904. B)Der blev målt tre individuelle gentagelsesafstande for to mus uden ændringer i forsøgsbetingelserne. En envejs ANOVA viste, at der var betydelig matchning mellem de gentagne scanninger med en p-værdi på 0,0041. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Co-lokaliseret SPECT / CT billeder af 0 og 6 timers luftveje i 2 mus med ROIs trukket på 0 og 6 timer skitserer højre lunge. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Figur 1: En video af vokal akkorder belyst af en fiberoptisk ledning med effekten af vejrtrækning visualiseret. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende filer. Klik her for at downloade disse filer.
Discussion
Den rolle, motile respiratoriske cilia i både sygdom og udvikling fortsætter med at udvikle sig og blive bedre værdsat. Synkron, metakronal slå af flere motile cilia på den apikale overflade af celler foring tracheobronchial træet generere cephalad flow producerer slimhinde clearance eller MCC. MCC er kompromitteret i ciliopatier som PCD22, erhvervede sygdomme som KOL18, og dens betydning bliver anerkendt i CHD'er, der ikke traditionelt anses for at være ciliopatier. Nylige data har vist respiratorisk ciliary dysfunktion i både CHD med heterotaxy23 og uden heterotaxy7. En sådan motile cilia dysfunktion viste sig at oversætte til større luftvejssymptomer9 samt større postoperativ sygelighed8. De fleste, hvis ikke alle, af disse sygdomme, har musemodeller til rådighed, og vores protokol til måling af MCC hos mus er et værdifuldt værktøj, der kan bruges til at teste potentiel terapi.
Dyremodeller giver nytte for forståelse af sygdomme og udvikling af terapier. In vivo dyrebilleddannelse giver yderligere nytte med evnen til at erhverve flere datapunkter fra de samme dyr, uden at det er nødvendigt at ofre dyrene, så efterforskerne kan følge langsgående sygdomsforløb samt undersøgelsens varighed af behandlingseffekter. Musen model af MCC er blevet udviklet i løbet af årtier af flere efterforskere, i første omgang udføres på beagle hunde ved hjælp af planar scintigraphy, en todimensionel nuklear billeddannelse teknik24. Teknikken blev tilpasset til brug i mus et årti senere, efterfulgt af tilpasning til SPECT imaging et årti efter, at25,26. Udviklingen af denne teknik i musemodeller var en stor udvikling i relevansen af denne teknik på grund af tilgængeligheden af flere musemodeller af menneskelige sygdomme som PCD, hvor ciliary-funktionen ændres betydeligt. MCC er blevet vurderet i musemodeller af lunge denervation og immunosuppression, og har potentiale til at blive brugt sammen med andre modeller19,26. MCC-måleundersøgelser hos humane patienter med luftvejssygdomme som CF, astma, PCD og ciliopatier forbundet med CHD er blevet udført og har givet resultater, som teknikken kan hjælpe både undersøgelser af lungefysiologi og terapeutisk effekt13.
En vigtig del af denne protokol er opsætning af anskaffelser med de korrekte billedparametre for at erhverve nøjagtige billeder til kvantificering. En række faktorer er afgørende, når du designer SPECT-anskaffelsesindstillinger, herunder hvilke kollimatorer der bruges, antallet af fremskrivninger, der skal erhverves pr. omdrejning, og rotationstrinstørrelse. Collimator udvælgelse er en vigtig faktor i følsomheden og afviklingen af erhvervelsen, og erhvervelse indstillinger kan være nødvendigt at skræddersy til collimator, der anvendes27. Alternativt, når du bruger større dyr som rotter, skal kollimatorerne justeres. Flere pinhole collimators for eksempel er mere følsomme, men man skal være forsigtig, når du vælger et trin størrelse for at undgå overlappende fremskrivninger og forårsager uønsket multiplexing, hvilket yderligere kan øge følsomheden af erhvervelsen på bekostning af nogle billede tvetydighed, der kan forårsage genopbygning artefakter25. Genopbygning setup er også nøglen til at generere kvantificerbare billeder. MAP3D er en almindeligt anvendt iterativ rekonstruktionsalgoritme, og PSF er en fælles genopbygningsmodel. Begge er pålidelige til rekonstruktion af billeder, men der skal udvises forsigtighed, når antallet af gentagelser og undersæt indstilles. Et større antal gentagelser vil øge den beregningstid, der kræves til genopbygningen, og øge kvaliteten af genopbygningen med faldende afkast ved yderligere stigning.
For at kvantificere billeder i ImageJ er det ideelle måleværktøj RawIntDen, som udskriver sumværdien af pixel i en markering. Når spect-data kvantificeres på tværs af lunge-ROI'er af forskellig størrelse, giver brugen af RawIntDen et absolut mål for antallet og undgår at justere målingen til roi-området, ligesom middelmålingen villevære 21.
Denne teknik har en række tilknyttede fejlkilder, som investigator skal være opmærksom på, når han anvender denne teknik. En bemærkelsesværdig confounder er brugen af bedøvelsesmidler. Isoflurane er en hurtigt virkende, inhaleret bedøvelsesmiddel, som musene genvinder fra hurtigt efter afslutningen af en erhvervelse. Der skal dog sørges for at give musene rigelig tid til at komme sig i deres bure og ikke holdes bedøvet længere end nødvendigt. I vores personlige erfaring (ikke-offentliggjorte data) mus, der blev holdt bedøvet kontinuerligt ved hjælp af inhaleret isofluran mellem 0 og 6 timers tid-punkt viste ubetydelig clearance. Ligeledes er en kontrolleret dosis bedøvelse også nødvendig for at sikre hurtig genopretning. Ved fastgørelse af dyret til pallen til billeddannelse bør fantomrøret, der bruges til medregistrering, holdes lavt på maven for at undgå, at artefakter overlapper lungerne. På samme måde skal du sørge for at fjerne metalmærker fra musen for at undgå artefakter fra røntgenspredning for at sikre et CT-billede af høj kvalitet.
Den nuværende MCC-protokol kan anvendes på utallige dyremodeller. Denne teknik har en ubetydelig effekt på dyrets sundhed scannet, tolereres godt af mus, og på grund af dette kan den bruges med sygdomsmodeller uden at risikere sundheden for allerede sarte mus. Styrken af denne metode kommer fra, at det er en in vivo-teknik, som giver mulighed for erhvervelse af konsekvente og repeterbare målinger af luftvejsfunktion uden at ofre dyr til punktafgiftsflyve for videomikroskopi, at ex vivo-modeller kræver26. Konsekvensen af denne teknik i produktionen af repeterbare målinger på tværs af flere scanninger af de samme dyr gør det muligt at behandle det samme dyr med forskellige agenser eller potentielle behandlingsstoffer, og statistiske sammenligninger foretaget mellem det samme dyr for at reducere biologisk variation, der er forbundet med enhver dyremodel, og derved reducere den prøvestørrelse, der er nødvendig for at vise statistisk signifikante forskelle.
Vurderingen af luftvejsfunktionen ved hjælp af MCC-teknikken kan justeres til en række dyremodeller og anvendes på mange forskellige modeller af luftvejssundhed samt test af nye behandlinger. Luftvejene af musemodeller af PCD kan vurderes ved hjælp af denne teknik samt modeller af KOL. Vores metode kan også bruges til at studere differentialvirkninger af forskellige bedøvelsesmidler på MCC, der er i almindelig klinisk brug. Endelig kan virkningerne af terapeutiske midler på luftvejene også vurderes ved hjælp af denne model. Som tidligere nævnt, men bærer gentagelse, da det er en in vivo måling det giver mulighed for gentagne MCC vurderinger i løbet af en sygdom, samt test fordele af terapeutiske indgreb over tid. Derudover er mus de mest almindelige forsøgsdyr, der bruges til at efterligne / studere menneskelige sygdomme, med i nogle tilfælde flere transgene musemodeller af menneskelig sygdom, der kan vælges fra.
Disclosures
Ingen i forbindelse med dette arbejde.
Acknowledgments
M.Z. og K.S.F. og dette arbejde blev støttet af et tilskud tildelt under Pitt Innovation Challenge (PInCh), gennem Clinical and Translational Science Institute ved University of Pittsburgh, og NHLBI R01 tilskud HL153407, tildelt M.Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 µm Unjacketed Fiber Optic Wire | Edmund Optics | 02-532 | |
| 99mTechnecium-Sulfur Colloid | Cardinal Health | ||
| Anesthesia Vaporizer | Vetland Medical | A13480 | |
| Durmont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software | |||
| Introcan Safety Catheters 20G 1inch | Fisher Scientific | NC1534477 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 118-2097 | |
| Mouse Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MSE-01 | |
| Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT | Siemens | ||
| Single Channel Anesthesia Stand | Summit Anesthesia Solutions | 22860 |
References
- Afzelius, B. A.
- Mitchell, D. R. The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles. Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).
- Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella. Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).
- Randell, S. H., Boucher, R. C. University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).
- Wanner, A., Salathe, M., O'Riordan, T. G.
- Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521 (7553), 520-524 (2015).
- Zahid, M., et al. Airway ciliary dysfunction and respiratory symptoms in patients with transposition of the great arteries. PLoS One. 13 (2), 0191605 (2018).
- Stewart, E., et al. Airway ciliary dysfunction: Association with adverse postoperative outcomes in nonheterotaxy congenital heart disease patients. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (2), 755-763 (2018).
- Garrod, A. S., et al. Airway ciliary dysfunction and sinopulmonary symptoms in patients with congenital heart disease. Annals of the American Thoracic Society. 11 (9), 1426-1432 (2014).
- Harden, B., et al. Increased postoperative respiratory complications in heterotaxy congenital heart disease patients with respiratory ciliary dysfunction. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 147 (4), 1291-1298 (2014).
- Leigh, M. W., et al. Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/Kartagener syndrome. Genetics in Medicine. 11 (7), 473-487 (2009).
- Donaldson, S. H., et al. Effect of ivacaftor on mucociliary clearance and clinical outcomes in cystic fibrosis patients with G551D-CFTR. JCI Insight. 3 (24), (2018).
- Donaldson, S. H., Corcoran, T. E., Laube, B. L., Bennett, W. D. Mucociliary clearance as an outcome measure for cystic fibrosis clinical research. Proceedings of the American Thoracic Society. 4 (4), 399-405 (2007).
- Ledowski, T., Hilmi, S., Paech, M. J. Bronchial mucus transport velocity in patients receiving anaesthesia with propofol and morphine or propofol and remifentanil. Anaesthesia. 61 (8), 747-751 (2006).
- Donnelley, M., Morgan, K. S., Siu, K. K., Parsons, D. W. Dry deposition of pollutant and marker particles onto live mouse airway surfaces enhances monitoring of individual particle mucociliary transit behaviour. Journal of Synchrotron Radiation. 19, Pt 4 551-558 (2012).
- Christopher, A. B., et al. The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia. Frontiers in Pediatrics. 2, 111 (2014).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Lam, H. C., et al. Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5212-5230 (2013).
- Bhashyam, A. R., et al. A pilot study to examine the effect of chronic treatment with immunosuppressive drugs on mucociliary clearance in a vagotomized murine model. PLoS One. 7 (9), 45312 (2012).
- Ortiz, J. L., et al. Evaluation of Mucociliary Clearance by Three Dimension Micro-CT-SPECT in Guinea Pig: Role of Bitter Taste Agonists. PLoS One. 11 (10), 0164399 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Solomon, G. M., et al. Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography. JCI Insight. 2 (5), 91702 (2017).
- Nakhleh, N., et al. High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy. Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).
- Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. K. Technique for aerosol deposition restricted to the nose in beagle dogs. Journal of Toxicology and Environmental Health. 23 (4), 519-525 (1988).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. Journal of Applied Physiology. 90 (3), 1111-1117 (2001).
- Bhashyam, A. R., et al. Vagal control of mucociliary clearance in murine lungs: a study in a chronic preparation. Autonomic Neuroscience. 154 (1-2), 74-78 (2010).
- Van Audenhaege, K., et al. Review of SPECT collimator selection, optimization, and fabrication for clinical and preclinical imaging. Medical Physics. 42 (8), 4796-4813 (2015).
