Summary
I denna publikation beskriver vi protokoll för bedömning av luftvägarna mucociliary clearance (MCC) hos möss in vivo med hjälp av dual-modality radionuklid imaging. Detta protokoll är utformat för en enda foton utsläpp datortomografi (SPECT) och datortomografi (CT) förvärv protokoll med mus hela kroppen (MWB) collimatatorer i ett dubbelt SPECT /CT system.
Abstract
Andningsmotilcilia, specialiserade organeller i cellen, fodrar den apatiska ytan av epitelceller som fodrar luftvägarna. Genom att slå på ett metakronalt, synkronalt sätt genererar dessa flera, motila, aktinbaserade organeller ett cephalad flytande flöde rensa luftvägarna av inhalerade föroreningar och patogener. Med ökande miljöföroreningar, nya viruspatogener och framväxande multiresistenta bakterier är ciliagenererad mucoiliary clearance (MCC) avgörande för att upprätthålla lunghälsan. MCC är också deprimerad i flera medfödda sjukdomar som primära ciliary dyskinesi, cystisk fibros samt förvärvade sjukdomar som kronisk obstruktiv lungsjukdom. Alla dessa störningar har etablerat, i vissa fall flera, musmodeller. I den här publikationen beskriver vi en metod med en liten mängd radioaktivitet och SPECT/CT-avbildning med dubbla modaliteter för att exakt och reproducerbart mäta MCC hos möss in vivo. Metoden möjliggör återhämtning av möss efter avbildning, vilket möjliggör seriella mätningar och testar potentiella terapier längs tid. Data i vilda möss visar reproducerbarheten av MCC-mätningen så länge adekvat uppmärksamhet på detaljer ägnas, och protokollet följs strikt.
Introduction
Cilia är mikrotubulebaserade cellulära organeller bevarade över evolutionär historia från alger till människor. De kommer från cellytor och har ett antal funktioner1, allt från erkännande av lokala miljösensoriska signaler till motilitet, funktioner som kan spåras tillbaka från människor till tidiga encelliga eukaryota organismer2,3. Cilia kan vara icke-motil och singel som fungerar som en cells specialiserade antenn för att bearbeta miljösignaler; eller motile och flera, slår i synkroniserade, metachronal vågor för att generera vätskeflöde, såsom i fodret i äggledarna och de övre och nedre luftvägarna, med undantag för de terminala bronkiolerna som leder till alveolerna1,2.
Den omfattande epitelial ytan av luftvägarna utsätts för en konstant spärreld av förorening i form av en mängd potentiellt farliga inhalerade föroreningar och patogener, vilket kräver ett försvar. En viktig försvarsmekanism är den mucociliary apparaten i tracheobronchial trädet, där ett kontinuerligt flöde av utsöndrat slem transporteras mekaniskt ut ur luftvägarna genom misshandel av flera motila cilia foder de apatiska ytorna i tracheo-bronkial epitelceller. Dessa funktion för att fånga in inhalerade föroreningar, och genom deras kontinuerliga, synkrona misshandel, transportera dem cephalad4,5.
Cilia har visat sig ha nyckelroller som i utvecklingen av vänster-höger mönstring i utvecklingen av embryon, där motile cilia vid den embryonala noden brytasymmetri 6. Mutationer i ciliarelaterade gener har kopplats till sjukdomar som medfödd hjärtsjukdom (CHD) på grund av hjärtats asymmetriska struktur6. Nyligen genomförda studier har rapporterat en hög incidens av ciliary dysfunktion i luftvägarna hos patienter med CHD, liksom en ökad prevalens av postoperativa luftvägarna komplikationer och kroniska luftvägarna symtom i övre och nedreluftvägarna 7,8,9,10. Patienter med CHD och ciliary dysfunktion, med eller utan heterotaxy, har visat sig ha ökad risk för luftvägarna komplikationer och negativa luftvägarna resultat postoperativt5,8,10. Utöver deras roller i signalering och utveckling, vikten av luftvägarna cilia har visats av ciliopathies, varav ett främsta exempel är primära ciliary dyskinesi (PCD). PCD är en medfödd sjukdom som härrör från ett antal mutationer som påverkar den motila luftvägarna cilia, vilket leder till återkommande lunginfektioner, bronkiectasis, och potentiellt behovet av lungtransplantation11. Dessutom, även om cilia är normala i cystisk fibros (CF), vanligaste medfödda störning i den kaukasiska befolkningen, är MCC nedsatt på grund av tjocka, trögflytande slem som härrör från mutationer i CFTRgenen 12. Det finns flera musmodeller av PCD och CF, liksom ett ständigt ökande antal modeller av CHD. I slutändan är cilia mångsidiga strukturer med många nyckelroller, och en metod för att bedöma funktionen av motile respiratory cilia in vivo kan vara värdefullt för preklinisk studie, och bedöma effekter av mutationer samt läkemedel på mucociliary clearance (MCC)13. Metoden skulle också vara värdefull för att bedöma effekterna av nya läkemedel, genterapi eller interventioner på MCC i dessa musmodeller.
Det finns många olika modeller som har använts för att bedöma MCC. En anmärkningsvärd metod innebär användning av metylenblå färgämne som har ingjutits i bronkerna, med clearance mätt genom fiberoptisk mätning av färgrörelse14. Denna metod begränsas av förmågan att observera färgämnets rörelse, vilket är mer rutinmässigt hos människor än i prekliniska musmodeller. En annan anmärkningsvärd metod är synkrotronfaskontraströntgenavbildning (PCXI), som kan användas för att spåra enskilda partiklar i en luftväg. Denna metod är relativt ny och inte allmänt tillgänglig15. Det finns många ex vivo metoder för att bedöma luftvägarna genom att excising en luftstrupe för videomikroskopi, men dessa modeller ger lite nytta hos mänskliga patienter16. Högupplösta tekniker för cilia imaging såsom optisk koherenstomografi är begränsade på samma sätt17.
I den här artikeln presenterar vi en reproducerbar metod för att mäta MCC in vivo som har använts för att mäta lung clearances i otaliga djurmodeller, samt studera MCC i kronisk obstruktiv lungsjukdom och bedöma effekterna av immunsuppressivaläkemedel 18,19. Denna metod spårar clearance av radiopharmaceutical 99mtechnetium-svavel kolloid (99mTc-Sc), en olöslig partikelradikal radiotracer, efter instillation i lungorna. Radionukliden kan sedan spåras med hjälp av en fotonemissionstomografi (SPECT)18,20. Vi har ytterligare förfinat denna teknik för att mäta MCC genom att använda dual modality SPECT och datortomografi (CT) imaging med samlokalisering av radioisotope räknas till lungorna och mäta minskningen av dessa räkningar över 6 timmar. Dubbelmodalitetsavbildning, med samregistrering av CT- och SPECT-bilder möjliggör korrekt lokalisering av strålningsräkningar till vår region av intresse, lungorna. Även om vi i detalj beskriver metoden för MCC-mätning hos möss, kan protokollet justeras för att studera MCC hos råttor. Collimatorerna skulle behöva justeras samt stråldosen. Enligt vår mening är mus MCC-skanningar mer tekniskt utmanande på grund av den lilla djurstorleken, men mer användbara än råttor på grund av det stora antalet etablerade musmodeller av ett antal mänskliga störningar. Dessutom, på grund av deras lägre kostnad och kostnad för underhåll i djurkolonier, är en större provstorlek mer genomförbar hos möss.
Protocol
University of Pittsburghs institutional animal care and use committee godkände alla djurprotokoll som anges i denna publikation innan något av dessa djurförsök utfördes.
OBS: Detta protokoll beskriver hur man utför in vivo mucociliary clearance studier med hjälp av radionuklid imaging med en dual-modality SPECT/CT scanner. De tekniker som demonstreras är systemkalibreringar, bedövning av möss, trakeal intubering av möss, ingjutning av isotopen i lungorna, dubbelmodalitetsavbildning, samregistrering av dessa bilder och analys.
1. Inställning av SPECT/CT-system
- Utforma ett lämpligt arbetsflöde och ställ in innan du kör experiment med levande djur.
- Använd ett SPECT-förvärv bestående av 60 projektioner med en stegstorlek på 6o mellan projektioner med en rotationsradie på 40 cm. CT-förvärvet består av 220 prognoser med en vinkel på 1,6o mellan prognoserna.
- Se till att systemet har rätt MWB-kollimatorer för möss och SPECT-avbildning på plats. Om de olämpliga kolliderarna är installerade använder du kollimatörsguiden för att installera rätt.
- Kör nödvändiga systemkalibreringar för att förbereda systemet för användning.
OBS: Skannerns SPECT- och CT-komponenter behöver kalibreras. Kalibrera CT-komponenterna med hjälp av en källkonditionering och en D/L-kalibrering (Dark/Light) en gång om dagen, en COS-kalibrering (Center Offset) varannan vecka och utvärdera röntgenmaskinvaran varje månad. SPECT-komponenterna måste kalibreras en gång om året.- För att utvärdera röntgenhårdvaran, kontrollera rutan Utvärdera röntgenhårdvara under CT-kalibreringar(Kompletterande CT-kalibreringsmeny).
- För att utföra källkonditionering, markera rutan Utför källkonditionering under CT-kalibreringar(Kompletterande CT-kalibreringsmeny).
- Om du vill utföra en D/L-kalibrering markerar du rutan D/L bredvid ct-anskaffningsprotokollet som används under experiment under CT-kalibreringar. Avmarkera alla andra protokoll ( KompletterandeCT-kalibreringsmeny).
- Om du vill utföra en COS-kalibrering ersätter du sängen med kalibreringsringsverktyget, justerar inställningarna för sängtyp för att matcha i rörelsekontrollinställningarna och markerar COS-rutan bredvid CT-anskaffningsprotokollet som används under experiment under CT-kalibreringar. Avmarkera alla andra protokoll ( KompletterandeCT-kalibreringsmeny, kompletterande kalibreringsring).
2. Musintubering och instillation
- Väg mössen som ska skannas. Om du skannar flera möss, var noga med att markera mössen för identifieringsändamål med metoder som öronslagning eller märkning av svansen.
- Bedöva en mus med 1,5% isofluran med ett gasflöde på 2 L/min O2 i en gaskammare i ~ 5 minuter för att producera anestesi av tillräckligt djup, tills andningen saktar ner till ~ 55-65 andetag per minut 16 (Figur 1A).
- Ta bort musen från kammaren och häng upp med de främre snedställningarna på ett intuberingsställ vid en lutning på 45o. Utrusta intuberingsstativet med en noskon för att säkerställa att musen bedövas under intubering (Figur 1B).
- Anslut ena änden av en 50 μm fiberoptisk tråd till en ljuskälla och trä en 20-gauge kanyl över den med hjälp av tråden för att fungera som en guide (Figur 1C).
- Öppna musens mun och dra tungan framåt med trubbiga tång. Tänd ledaren och använd den för att visualisera stämbanden (Bild 1D).
- För guidetråden genom stämbanden så att tråden är precis bortom stämbanden och vilar i den övre luftstrupen. Skjut 1 tums kanyl framåt längs tråden för att intubera musen och passera kanylen tillräckligt djupt så att navet i den är mot djurets snedställningar (Figur 1E). Ta bort kabeln och lämna kanylen på plats.
- Testa intubering genom att kort ansluta kanylen med ett finger och kontrollera förändringar i andningen. Stoppad andning eller ansträngd andning under pluggning och accelererad andning vid frisättning är tecken på korrekt trakeal intubation. Om det inte finns någon förändring i andningsmönstren vid pluggning av kanylen, är den senare sannolikt i matstrupen.
- Förbered 0,2 mCi 99mtechnetium-svavel kolloid(99mTc-Sc) i en volym av 10 μL och pipett i kanylen. Låt musen spontant andas in den i lungorna över 1-2 min (Bild 1F). Ta bort kanylen innan du överför musen till skannerns pall.
Radionukliden förbereddes och filtrerades av Cardinal Health.
3. SPECT/CT Imaging
- Överför musen till en 25 mm pall med en noskon och säkra med tejp, var noga med att inte tejpa bröstet och buken för hårt för att undvika försämrad andning. Var noga med att ta bort alla metallörhängen som är fästa vid musen.
- Förbered en radioaktiv fantom bestående av 0,05 mCi i 200 μL och placera denna mängd i ett 0,2 ml PCR-rör. Placera röret genom att tejpa på pallen under musens underliv och undvik överlappning med lungorna.
OBS: Fantomen används för att samregistrera CT- och SPECT-bilder, samt en negativ kontroll för clearance. - Sätt in musen i SPECT/CT-systemet, välj avbildningsarbetsflödet och kör installationsprogrammet.
- Ställ in detektorernas placering på musen och kör avbildningsarbetsflödet.
- Förbered en bur för möss som har fått radioaktivitet efter proceduren, med obegränsad tillgång till mat och vatten, och tydlig märkning med hjälp av ett klistermärke för strålsäkerhet.
- När arbetsflödet är klart tar du bort musen från bildpallen och låter den återhämta sig i den förberedda buren under en tid av 6 timmar mellan skanningarna (slutet av skanning 1 till början av skanning 2) med ad libitum tillgång till mat och vatten. 6 h valdes eftersom det motsvarar den tidsperiod under vilken linjär clearance beroende på ciliafunktion sker med mycket lite alveolär clearance.
- Efter 6 timmar, bedöva musen igen och skanna, tillsammans med fantomen, med samma arbetsflöde för att mäta mängden isotop som rensats från luftvägarna.
OBS: Det är viktigt att låta musen återhämta sig eftersom oavbruten anestesi med isofluran i 6 timmar kommer att leda till en betydande ciliadepressiv effekt, vilket resulterar i nära noll mucociliary clearances.
4. Analys
- Efter avbildning utför du efter bearbetning för att rekonstruera kompletta 3D-stackbilder.
- Histogramma SPECT-bilderna med fabriksstandardinställningarna för 99mTc och rekonstruera sedan med hjälp av en MAP3D-algoritm och punktspridningsfunktion (PSF) rekonstruktion.
OBS: Rekonstruktionen utfördes med 8 iterationer och 6 delmängder. En effektiv rekonstruktion kräver ett förhållande mellan delmängder och prognoser klockan 1:10 eller jämnt fördelat på antalet prognoser, så 6 delmängder användes på grund av förvärvet med hjälp av 60 prognoser. - Rekonstruera CT-bilderna med hjälp av Feldkamp-algoritmen och ett Shepp-Logan-filter.
OBS: Rekonstruktionen utfördes med hjälp av 4 iterationer.
- Histogramma SPECT-bilderna med fabriksstandardinställningarna för 99mTc och rekonstruera sedan med hjälp av en MAP3D-algoritm och punktspridningsfunktion (PSF) rekonstruktion.
- Bearbeta CT- och SPECT-bilderna i FIJI ImageJ21 med hjälp av reslice-verktyget för att generera koronalvybilder från standardaxiella bilder. Utför sedan en z-stack-summaprojektion på SPECT-bilden för att lägga till räkningsdata från varje segment och generera en enda bild för enkel analys.
- Ändra storlek på och samregistrera CT- och SPECT-bilderna med hjälp av fantomröret Eppendorf som referens (figur 2A,B). Spåra och använd konsekventa storleksmätningar i alla prover.
- Binarisera CT-avbildningen med automatisk tröskel, följt av att invertera stacken och utföra en z-stack-summaprojektion för att generera en kontur av lungorna för analys (figur 2C).
- Rotera CT- och SPECT-bilderna och sammanfoga bilden med hjälp av kanalverktygen. Beräkna MCC genom att rita en ROI runt höger lunga och mäta (Figur 2D).
OBS: Denna mätning kommer att vara av det totala antalet i höger lunga för 0 och 6 timmars tidpunkter, med 6 timmars bilder korrigerade för radioaktivt sönderfall med formeln: N(t) = N0e−t. 99m Tc-Sc har en sönderfallskonstant på 3,21e−5 per sekund med en halveringstid på ~ 6 timmar. Dessa värden kan sedan användas för att beräkna en procent clearance.
OBS: Höger lunga väljs för ROI-ritning och mätning räknas eftersom mucociliary clearance kommer att transportera radioisotope ur lungorna till svalget varifrån det kommer att sväljas och hamna i magen. Ganska ofta kan räkningar ses i magen som kan överlappa med vänster lunga och därmed producera felaktiga räkningar. Denna förvirrande kan undvikas genom att mäta räkningar endast i höger lunga.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll bedövade vi möss i en isoflurankammare (Figur 1A). Efter att ha uppnått en tillräcklig nivå av anestesi placerades möss på vertikala stöd (figur 1B) och stämbanden visualiserades med hjälp av en upplyst guidetråd (Figur 1C-1D). Mössen intuberades och ingjutits med 0,2 mCi 99mTc-Sc i volymer på 10 μL genom en kanyl och möss som fick spontant andas in i lungorna (Figur 1E-1F). Efter bildförvärv och bearbetning var CT- och SPECT-bilderna colocalized (Figur 2A) med fantomröret som landmärke (Figur 2B). Lungmasker genererades från CT-bilden (Figur 2C) och användes för att rita ROIs runt höger lunga för analys vid 0 (Figur 2D) och 6 timmar (Figur 2E-2F). För att testa protokollets reproducerbarhet skannades totalt 8 möss två gånger under olika dagar med identiska experimentella tillstånd, med analys med hjälp av ett parat t-test som inte visade någon signifikant skillnad mellan de upprepade skanningarna (p-värde=0,9904) (figur 3A). Ytterligare 2 möss skannades tre gånger under olika dagar med identiska experimentella tillstånd, med analys med enkelvägs ANOVA som visade signifikant matchning mellan de upprepade skanningarna (p-värde på 0,0041) (Figur 3B). Totalt 8 möss skannades och två representativa bilder visades (Figur 4).
Figur 1: Musintubering och isotopinstillation. Bilder av de steg som behövs för att intubera och ingjuta isotop i luftvägarna. A) Musen bedövas i en kammare. B) Den sövda musen placeras på ett vertikalt stöd, upphängt av de främre snedställningarna. C) En belyst 0,5 mm fiberoptisk tråd som fungerar som styrtråd bereds genom att köra den genom en 20 G kanyl. D) Musens mun öppnas med tång och tänds med hjälp av den upplysta ledaren för att visualisera stämbanden. E) Kanylen trycks över stämbanden och ledaren tas bort. F) Löslig isotop ingjuts i kanylen med hjälp av en pipett och musen får spontant andas in isotopen i lungorna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2: SPECT/CT-bilder av en MCC-skanning. A) En SPECT-bild som har samlokalisering med en CT-bild. B) En CT-bild med ett synligt fantomrör som användes för samlokalisering. C) En mask av luftvägarna som härleds genom att binarisera CT-bilden och utföra en z-stack summa projektion. D) CT-masken samlokalisering med SPECT-bilden. En ROI för analys har dragits runt den högra lungan. E) En luftvägsmask klockan 6. F) En CT och SPECT samlokaliseringsbild av luftvägarna vid 6 timmar med en ROI för analys. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Klareringsmätningar av samma möss över flera skanningar. A) Två individuella upprepande clearance mättes för 8 möss utan förändringar i experimentella förhållanden. Ett parat t-test visade att det inte fanns någon signifikant skillnad mellan de upprepade skanningarna med ett p-värde på 0,9904. B) Tre individuella upprepande clearances mättes för två möss utan förändringar i experimentella förhållanden. En enkelvägs ANOVA visade att det fanns betydande matchning mellan de upprepade skanningarna med ett p-värde på 0,0041. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Sam lokaliserade SPECT/CT-bilder av 0 och 6 timmars luftvägar i 2 möss med ROI dragna vid 0 och 6 timmar som beskriver rätt lunga. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: En video av stämbanden upplysta av en fiberoptisk tråd med effekten av andning visualiserad. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande filer. Klicka här för att ladda ner dessa filer.
Discussion
Motile respiratory cilias roll i både sjukdom och utveckling fortsätter att utvecklas och uppskattas bättre. Synkron, metakron misshandel av flera motila cilia på den akrona ytan av celler som fodrar trakeobronchial trädet generera cephalad flöde producerar mucociliary clearance eller MCC. MCC äventyras i ciliopathies som PCD22,förvärvade sjukdomar som KOL18, och dess betydelse erkänns i CHDs, inte traditionellt anses vara ciliopathies. Nya data har visat respiratorisk ciliary dysfunktion i både CHD med heterotaxy23 och utan heterotaxy7. Sådan motile cilia dysfunktion visade sig översättas till störreluftvägarna symtom 9 samt större postoperativa sjuklighet8. De flesta, om inte alla, av dessa sjukdomar har musmodeller tillgängliga och vårt protokoll för att mäta MCC hos möss är ett värdefullt verktyg som kan användas för att testa potentiella terapier.
Djurmodeller ger nytta för att förstå sjukdomar och utveckla terapier. In vivo djuravbildning ger ytterligare nytta med förmågan att förvärva flera datapunkter från samma djur, utan att behöva offra djuren, så att utredarna kan följa längsgående sjukdomsförloppet samt studiens varaktighet av behandlingseffekter. Musmodellen av MCC har utvecklats under årtionden av flera utredare, ursprungligen utförs på beagle hundar med hjälp av planar scintigrafi, en tvådimensionell nukleär bildteknik24. Tekniken anpassades för användning på möss ett decennium senare, följt av anpassning till SPECT-avbildning ett decennium efterdet 25,26. Utvecklingen av denna teknik i musmodeller var en viktig utveckling i relevansen av denna teknik, på grund av tillgången till flera musmodeller av mänskliga sjukdomar som PCD där ciliary funktion ändras avsevärt. MCC har bedömts i musmodeller av lungförnekelse och immunsuppression, och har potential att användas tillsammans med andra modeller19,26. MCC-mätstudier på mänskliga patienter med luftvägssjukdomar som CF, astma, PCD och ciliopathies associerade med CHD har utförts, och har gett resultat att tekniken kan hjälpa både studier av lungfysiologi och terapeutisk effekt13.
En viktig del av detta protokoll är att ställa in förvärv med rätt bildparametrar för att få korrekta bilder för kvantifiering. Ett antal faktorer är viktiga när du utformar SPECT-anskaffningsinställningar, inklusive vilka kollimatorer som används, antalet projektioner att förvärva per varv och rotationsstegstorlek. Collimatorval är en viktig faktor för förvärvets känslighet och upplösning, och förvärvsinställningarna kan behöva skräddarsys för den kollimatör som används27. Alternativt, när man använder större djur som råttor, skulle collimatörerna behöva justeras. Flera pinhole collimators till exempel är känsligare, men försiktighet bör vidtas när du väljer en stegstorlek för att undvika överlappande projektioner och orsaka oönskad multiplexering, vilket ytterligare kan öka känsligheten för förvärvet på bekostnad av vissa bild tvetydigheter som kan orsaka rekonstruktion artefakter25. Rekonstruktionsinställning är också nyckeln till att generera kvantifierbara bilder. MAP3D är en vanlig iterativ rekonstruktionsalgoritm, och PSF är en vanlig rekonstruktionsmodell. Båda är tillförlitliga för att rekonstruera bilder, men försiktighet bör vidtas när du ställer in antalet iterationer och delmängder. Ett högre antal iterationer kommer att öka den beräkningstid som krävs för återuppbyggnaden och öka kvaliteten på återuppbyggnaden med minskande avkastning vid ytterligare ökning.
För att kvantifiera bilder i ImageJ är det perfekta mätverktyget som ska användas RawIntDen, som matar ut det summavärdet för pixlar i en markering. Vid kvantifiering av SPECT-data över olika storleksanpassade lung-ROI ger användningen av RawIntDen ett absolut mått på antal och undviker att justera mätningen till ROI-området, som den genomsnittligamätningen skulle 21.
Denna teknik har ett antal associerade felkällor som prövaren bör vara medveten om när man tillämpar denna teknik. En anmärkningsvärd confounder är användningen av bedövningsmedel. Isofluran är ett snabbverkande, inhalerat bedövningsmedel som mössen återhämtar sig från snabbt efter slutförandet av ett förvärv. Man bör dock vara noga med att ge mössen gott om tid att återhämta sig i sina burar och inte hållas sövd längre än nödvändigt. Enligt vår personliga erfarenhet (opublicerade data) möss som hölls bedövade kontinuerligt med inhalerad isofluran mellan 0 och 6 timmars tidspunkt visade försumbar clearance. På samma sätt är en kontrollerad dos bedövningsmedel också nödvändig för att säkerställa snabb återhämtning. Vid fasthållning av djuret på pallen för avbildning bör fantomröret som används för samregistrering hållas lågt på magen för att undvika att artefakter överlappar lungorna. På samma sätt, för att säkerställa en CT-bild av hög kvalitet, var noga med att ta bort alla metalltaggar från musen för att undvika artefakter från röntgenspridning.
Det nuvarande MCC-protokollet kan tillämpas på otaliga djurmodeller. Denna teknik har en försumbar effekt på djurets hälsa skannad, tolereras väl av möss, och på grund av detta kan den användas med sjukdomsmodeller utan att riskera hälsan hos redan känsliga möss. Styrkan i denna metod kommer från att det är en in vivo-teknik, vilket gör det möjligt att förvärva konsekventa och repeterbara mätningar av luftvägsfunktionen utan att djuren offras för att punktskatta luftstrupar för videomikroskopi, som ex vivo-modellerkräver 26. Konsekvensen i denna teknik vid framställning av repeterbara mätningar över flera skanningar av samma djur gör det möjligt att behandla samma djur med olika agenser eller potentiella terapier, och statistiska jämförelser görs mellan samma djur för att minska den biologiska variabiliteten hos någon djurmodell, vilket minskar den provstorlek som behövs för att uppvisa statistiskt signifikanta skillnader.
Bedömningen av luftvägsfunktionen med MCC-tekniken kan anpassas till en mängd olika djurmodeller och tillämpas på många olika modeller av luftvägshälsa, samt testa nya terapier. Luftvägarna hos musmodeller av PCD kan bedömas med hjälp av denna teknik, liksom modeller av KOL. Vår metod kan också användas för att studera differentiella effekter av olika bedövningsmedel på MCC som är i vanlig klinisk användning. Slutligen kan effekterna av terapeutiska medel på luftvägarna också bedömas med hjälp av denna modell. Som tidigare nämnts men bär upprepning, eftersom det är en in vivo-mätning möjliggör det upprepade MCC-bedömningar under en sjukdom, liksom testfördelar med terapeutiska interventioner över tid. Dessutom är möss de vanligaste laboratoriedjuren som används för att efterlikna / studera mänskliga sjukdomar, med i vissa fall flera transgena musmodeller av mänsklig sjukdom tillgängliga att välja mellan.
Disclosures
Ingen relaterad till det här arbetet.
Acknowledgments
M.Z. och K.S.F. och detta arbete stöddes av ett bidrag som tilldelades inom ramen för Pitt Innovation Challenge (PInCh), genom Clinical and Translational Science Institute vid University of Pittsburgh, och NHLBI R01-stipendiet HL153407, tilldelat M.Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 µm Unjacketed Fiber Optic Wire | Edmund Optics | 02-532 | |
| 99mTechnecium-Sulfur Colloid | Cardinal Health | ||
| Anesthesia Vaporizer | Vetland Medical | A13480 | |
| Durmont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software | |||
| Introcan Safety Catheters 20G 1inch | Fisher Scientific | NC1534477 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 118-2097 | |
| Mouse Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MSE-01 | |
| Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT | Siemens | ||
| Single Channel Anesthesia Stand | Summit Anesthesia Solutions | 22860 |
References
- Afzelius, B. A.
- Mitchell, D. R. The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles. Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).
- Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella. Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).
- Randell, S. H., Boucher, R. C. University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).
- Wanner, A., Salathe, M., O'Riordan, T. G.
- Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521 (7553), 520-524 (2015).
- Zahid, M., et al. Airway ciliary dysfunction and respiratory symptoms in patients with transposition of the great arteries. PLoS One. 13 (2), 0191605 (2018).
- Stewart, E., et al. Airway ciliary dysfunction: Association with adverse postoperative outcomes in nonheterotaxy congenital heart disease patients. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (2), 755-763 (2018).
- Garrod, A. S., et al. Airway ciliary dysfunction and sinopulmonary symptoms in patients with congenital heart disease. Annals of the American Thoracic Society. 11 (9), 1426-1432 (2014).
- Harden, B., et al. Increased postoperative respiratory complications in heterotaxy congenital heart disease patients with respiratory ciliary dysfunction. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 147 (4), 1291-1298 (2014).
- Leigh, M. W., et al. Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/Kartagener syndrome. Genetics in Medicine. 11 (7), 473-487 (2009).
- Donaldson, S. H., et al. Effect of ivacaftor on mucociliary clearance and clinical outcomes in cystic fibrosis patients with G551D-CFTR. JCI Insight. 3 (24), (2018).
- Donaldson, S. H., Corcoran, T. E., Laube, B. L., Bennett, W. D. Mucociliary clearance as an outcome measure for cystic fibrosis clinical research. Proceedings of the American Thoracic Society. 4 (4), 399-405 (2007).
- Ledowski, T., Hilmi, S., Paech, M. J. Bronchial mucus transport velocity in patients receiving anaesthesia with propofol and morphine or propofol and remifentanil. Anaesthesia. 61 (8), 747-751 (2006).
- Donnelley, M., Morgan, K. S., Siu, K. K., Parsons, D. W. Dry deposition of pollutant and marker particles onto live mouse airway surfaces enhances monitoring of individual particle mucociliary transit behaviour. Journal of Synchrotron Radiation. 19, Pt 4 551-558 (2012).
- Christopher, A. B., et al. The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia. Frontiers in Pediatrics. 2, 111 (2014).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Lam, H. C., et al. Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5212-5230 (2013).
- Bhashyam, A. R., et al. A pilot study to examine the effect of chronic treatment with immunosuppressive drugs on mucociliary clearance in a vagotomized murine model. PLoS One. 7 (9), 45312 (2012).
- Ortiz, J. L., et al. Evaluation of Mucociliary Clearance by Three Dimension Micro-CT-SPECT in Guinea Pig: Role of Bitter Taste Agonists. PLoS One. 11 (10), 0164399 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Solomon, G. M., et al. Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography. JCI Insight. 2 (5), 91702 (2017).
- Nakhleh, N., et al. High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy. Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).
- Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. K. Technique for aerosol deposition restricted to the nose in beagle dogs. Journal of Toxicology and Environmental Health. 23 (4), 519-525 (1988).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. Journal of Applied Physiology. 90 (3), 1111-1117 (2001).
- Bhashyam, A. R., et al. Vagal control of mucociliary clearance in murine lungs: a study in a chronic preparation. Autonomic Neuroscience. 154 (1-2), 74-78 (2010).
- Van Audenhaege, K., et al. Review of SPECT collimator selection, optimization, and fabrication for clinical and preclinical imaging. Medical Physics. 42 (8), 4796-4813 (2015).
