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Medicina

Induktion und Analyse von oxidativem Stress in Dornröschen-Transposon-transfizierten menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen

Published: December 11, 2020
doi:
10.3791/61957
, , , , ,
1Experimental Ophthalmology,University of Geneva, 2Department of Ophthalmology,University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Wir stellen ein Protokoll für die Entwicklung und Verwendung eines oxidativen Stressmodells vor, indemwir retinale Pigmentepithelzellen mit H2O2behandeln und Zellmorphologie, Lebensfähigkeit, Dichte, Glutathion und UCP-2-Spiegel analysieren. Es ist ein nützliches Modell, um die antioxidative Wirkung von Proteinen zu untersuchen, die von Transposon-transfizierten Zellen sezerniert werden, um neuroretinale Degeneration zu behandeln.

Abstract

Oxidativer Stress spielt eine entscheidende Rolle bei mehreren degenerativen Erkrankungen, einschließlich der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), einer Pathologie, von der weltweit etwa 30 Millionen Patienten betroffen sind. Es führt zu einer Abnahme der retinalen Pigmentepithel (RPE) -synthetisierten neuroprotektiven Faktoren, z. B. Pigmentepithel-abgeleiteter Faktor (PEDF) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), gefolgt vom Verlust von RPE-Zellen und schließlich dem Tod von Photorezeptoren und retinalen Ganglienzellen (RGC). Wir stellen die Hypothese auf, dass die Rekonstitution der neuroprotektiven und neurogenen netztinalen Umgebung durch die subretinale Transplantation von transfizierten RPE-Zellen, die PEDF und GM-CSF überexprimieren, das Potenzial hat, die Degeneration der Netzhaut zu verhindern, indem sie die Auswirkungen von oxidativem Stress mildert, Entzündungen hemmt und das Überleben der Zellen unterstützt. Mit dem Sleeping Beauty Transposon-System (SB100X) wurden menschliche RPE-Zellen mit den PEDF- und GM-CSF-Genen transfiziert und zeigten eine stabile Genintegration, langfristige Genexpression und Proteinsekretion mittels qPCR, Western Blot, ELISA und Immunfluoreszenz. Um die Funktionalität und Die Wirksamkeit der von den transfizierten RPE-Zellen sezernierten PEDF und GM-CSF zu bestätigen, haben wir einen In-vitro-Assay entwickelt, um die Reduktion vonH2O2-induziertemoxidativem Stress auf RPE-Zellen in Kultur zu quantifizieren. Der Zellschutz wurde durch die Analyse der Zellmorphologie, der Dichte, des intrazellulären Glutathionspiegels, der UCP2-Genexpression und der Zelllebensfähigkeit bewertet. Sowohl transfizierte RPE-Zellen, die PEDF und/oder GM-CSF überexprimieren, als auch Zellen, die nicht transfiziert, aber mit PEDF und/oder GM-CSF (kommerziell erhältlich oder aus transfizierten Zellen gereinigt) vorbehandelt wurden, zeigten im Vergleich zu nicht behandelten Kontrollen einen signifikanten antioxidativen Zellschutz. Das vorliegendeH2O2-Modellist ein einfacher und effektiver Ansatz zur Bewertung der antioxidativen Wirkung von Faktoren, die zur Behandlung von AMD oder ähnlichen neurodegenerativen Erkrankungen wirksam sein können.

Introduction

Das hier beschriebene Modell bietet einen nützlichen Ansatz, um die Wirksamkeit biopharmazeutischer Wirkstoffe zur Reduzierung von oxidativem Stress in Zellen zu bewerten. Wir haben das Modell verwendet, um die schützenden Wirkungen von PEDF und GM-CSF auf denH2O2-vermitteltenoxidativen Stress auf retinale Pigmentepithelzellen, die hohen Konzentrationen vonO2und sichtbarem Licht ausgesetzt sind, und die Phagozytose von Photorezeptor-Außensegmentmembranen zu untersuchen, wodurch signifikante Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt werden1. (2)Die Mitgliedstaaten sind der Ansicht, Sie gelten als hauptverursacher der Pathogenese der avaskulären altersbedingten Makuladegeneration (aAMD)3,4,5,6,7,8. Außerdem gibt es eine Abnahme der RPE-synthetisierten neuroprotektiven Faktoren, insbesondere des Pigmentepithel-abgeleiteten Faktors (PEDF), der insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGFs) und des Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF), was zur Dysfunktion und zum Verlust von RPE-Zellen führt, gefolgt vom Tod durch Photorezeptoren und retinale Ganglienzellen (RGC)3,4,5 . AMD ist eine komplexe Erkrankung, die aus der Wechselwirkung zwischen metabolischen, funktionellen, genetischen und Umweltfaktorenresultiert 4. Der Mangel an Behandlungen für aAMD ist die Hauptursache für Blindheit bei Patienten älter als 60 Jahre in Industrieländern9,10. Die Rekonstitution der neuroprotektiven und neurogenen Netzhautumgebung durch die subretinale Transplantation genetisch veränderter RPE-Zellen, die PEDF und GM-CSF überexprimieren, hat das Potenzial, eine Netzhautdegeneration zu verhindern, indem die Auswirkungen von oxidativem Stress gemildert, Entzündungen gehemmt und das Überleben der Zellen unterstütztwerden 11,12,13,14,15,16 . Obwohl es mehrere Methoden gibt, um Gene an Zellen zu liefern, haben wir das nicht-virale hyperaktive Dornröschen-Transposon-System gewählt, um die PEDF- und GM-CSF-Gene an RPE-Zellen zu liefern, aufgrund seines Sicherheitsprofils, der Integration der Gene in das Genom der Wirtszellen und seiner Neigung, die gelieferten Gene in nicht-transkriptionell aktive Stellen zu integrieren, wie wir zuvor gezeigt haben17. 18,19.

Zellulärer oxidativer Stress kann in Zellen induziert werden, die in vitrodurch mehrere oxidative Wirkstoffe kultiviert werden, einschließlich Wasserstoffperoxid(H2O2),4-Hydroynonenal (HNE), Tertbutylhydroperoxid (tBH), hohe Sauerstoffspannungen und sichtbares Licht (Vollspektrum- oder UV-Bestrahlung)20,21. Hohe Sauerstoffspannungen und Licht erfordern spezielle Geräte und Bedingungen, die die Übertragbarkeit auf andere Systeme einschränken. Wirkstoffe wieH2O2,HNE und tBH induzieren überlappende molekulare und zelluläre Veränderungen des oxidativen Stresses. Wir wählten H2O2,um die antioxidative Aktivität von PEDF und GM-CSF zu testen, weil es praktisch und biologisch relevant ist, da es von RPE-Zellen als reaktives Sauerstoffzwischenprodukt während der Photorezeptor-Phagozytose des äußeren Segments22 produziert wird und in Augengewebe in vivo gefunden wird 23. Da die Oxidation von Glutathion teilweise für die Produktion vonH2O2im Auge verantwortlich sein kann, haben wir in unseren Studien die GSH/Glutathion-Spiegel analysiert, die mitH2O2-induziertemoxidativem Stress und der Regenerationsfähigkeit der Zellenzusammenhängen 21,22. Die Analyse des Glutathionspiegels ist besonders relevant, da es an den antioxidativen Schutzmechanismen im Augebeteiligt ist 24. Die Exposition gegenüber H2O2wird häufig als Modell verwendet, um die Anfälligkeit für oxidativen Stress und die antioxidative Aktivität der RPE-Zellen1,25,26,27,28,29,30zuuntersuchen, und zeigt zusätzlich Ähnlichkeiten mit lichtinduzierten oxidativen Stressschäden, einer “physiologischen” Quelle von oxidativem Stress21.

Um die Funktionalität und Wirksamkeit neuroprotektiver Faktoren zu bewerten, haben wir ein In-vitro-Modell entwickelt, das die Analyse ermöglicht, um die antioxidative Wirkung von Wachstumsfaktoren zu quantifizieren, die von Zellen exprimiert werden, die genetisch verändert wurden, um PEDF und GM-CSF zu überexprimieren. Hier zeigen wir, dass RPE-Zellen, die mit den Genen für PEDF und GM-CSF transfiziert wurden, resistenter gegen die schädlichen Wirkungen von H2O2 sind als nicht-transfizierte Kontrollzellen, wie Zellmorphologie, Dichte, Lebensfähigkeit, intrazellulärer Glutathionspiegel und Expression des UCP2-Gens zeigen, das für das mitochondriale Entkopplungsprotein 2 kodiert, das nachweislich reaktive Sauerstoffspezies (ROS)reduziert 31.

Protocol

Verfahren zur Entnahme und Verwendung menschlicher Augen wurden von der kantonalen Ethikkommission für Forschung (Nr. 2016-01726) genehmigt. 1. Zellisolierung und Kulturbedingungen Humane ARPE-19 Zelllinie Kultur 5 x 105 ARPE-19-Zellen, eine humane RPE-Zelllinie, in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/Ham’s F-12), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 80 U/ml Penicillin, 80 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Amphotericin B (kom…

Representative Results

Induktion von oxidativem Stress in menschlichen retinalen PigmentepithelzellenARPE-19 und primäre hRPE-Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen vonH2O2für 24 h behandelt und der intrazelluläre Spiegel des Antioxidans Glutathion quantifiziert (Abbildung 2A,B). H2O2 bei 50 μM und 100 μM hatte keinen Einfluss auf die Glutathionproduktion, während bei 350 μM eine signifikante…

Discussion

Das hier vorgestellte Protokoll bietet einen Ansatz zur Analyse der antioxidativen und schützenden Funktion von PEDF und GM-CSF, die von transfizierten Zellen produziert werden, die auf Zellen angewendet werden können, die mit jedem vermeintlich vorteilhaften Gen transfiziert sind. Bei gentherapeutischen Strategien, die das Ziel haben, Proteine durch Transplantation genetisch veränderter Zellen an Gewebe abzugeben, ist es wichtig, Informationen über das Niveau der Proteinexpression, die Langlebigkeit der Expression u…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Gregg Sealy und Alain Conti für die hervorragende technische Unterstützung sowie Prof. Zsuzsanna Izsvák vom Max-Delbrück-Centrum in Berlin für die freundliche Bereitstellung der pSB100X- und pT2-CAGGS- Venus-Plasmide. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds und der Europäischen Kommission im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms unterstützt. Z.I wurde gefördert durch den Europäischen Forschungsrat, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301
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Riferimenti

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Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).
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