JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Medicina

Induksjon og analyse av oksidativt stress i sovende skjønnhet transposon-transfekterte humane retinal pigment epitelceller

Published: December 11, 2020
doi:
10.3791/61957
, , , , ,
1Experimental Ophthalmology,University of Geneva, 2Department of Ophthalmology,University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Vi presenterer en protokoll for utvikling og bruk av en oksidativ stressmodell ved å behandle retinal pigment epitelceller med H2O2, analysere cellemorfologi, levedyktighet, tetthet, glutathione og UCP-2 nivå. Det er en nyttig modell for å undersøke antioksidanteffekten av proteiner utskilt av transposon-transfekerte celler for å behandle nevroretinal degenerasjon.

Abstract

Oksidativt stress spiller en kritisk rolle i flere degenerative sykdommer, inkludert aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), en patologi som påvirker ~ 30 millioner pasienter over hele verden. Det fører til en reduksjon i retinal pigment epitel (RPE)-syntetisert neuroprotective faktorer, for eksempel pigment epitel-avledet faktor (PEDF) og granulocyte-makrophage kolonistimulerende faktor (GM-CSF), etterfulgt av tap av RPE celler, og til slutt fotoreseptor og retinal ganglion celle (RGC) død. Vi hypoteser at rekonstituering av nevrobeskyttende og nevrogen retinal miljø ved subretinal transplantasjon av transfected RPE celler overekspresserende PEDF og GM-CSF har potensial til å forhindre retinal degenerasjon ved å redusere effekten av oksidativt stress, hemme betennelse, og støtte celle overlevelse. Ved hjelp av Sleeping Beauty transposon-systemet (SB100X) har menneskelige RPE-celler blitt transfektet med PEDF- og GM-CSF-genene og vist stabil genintegrasjon, langsiktig genuttrykk og proteinsekresjon ved hjelp av qPCR, vestlig blot, ELISA og immunfluorescence. For å bekrefte funksjonaliteten og styrken til PEDF og GM-CSF utskilt av de transfekterte RPE-cellene, har vi utviklet en in vitro-analyse for å kvantifisere reduksjonen av H2O2-indusert oksidativt stress på RPE-celler i kultur. Cellebeskyttelse ble evaluert ved å analysere cellemorfologi, tetthet, intracellulært nivå av glutathione, UCP2 genuttrykk og celle levedyktighet. Begge, transfekerte RPE-celler som overekspresserte PEDF og/eller GM-CSF og celler som ikke var transfekterte, men forbehandlet med PEDF og/eller GM-CSF (kommersielt tilgjengelig eller renset fra transfekterte celler) viste betydelig antioksidantcellebeskyttelse sammenlignet med ikke-behandlede kontroller. Den nåværende H2O2-modellener en enkel og effektiv tilnærming for å evaluere antioksidanteffekten av faktorer som kan være effektive for å behandle AMD eller lignende nevrodegenerative sykdommer.

Introduction

Modellen beskrevet her, tilbyr en nyttig tilnærming for å evaluere effektiviteten avbiofarmaceutiske midler for å redusere oksidativt stress i celler. Vi har brukt modellen til å undersøke de beskyttende effektene av PEDF og GM-CSF på H2O2-mediertoksidativt stress på retinal pigment epitelceller, som er utsatt for høye nivåer av O2, og synlig lys, og fagocytose av fotoreseptor ytre segmentmembraner, genererer betydelige nivåer av reaktive oksygenarter (ROS)1, 2. De regnes som en stor bidragsyter til patogenesen av avascular aldersrelatert makuladegenerasjon (aAMD)3,4,5,6,7,8. Dessuten er det en reduksjon i RPE-syntetiserte nevrobeskyttende faktorer, spesielt pigment epitel-avledet faktor (PEDF), insulin-lignende vekstfaktorer (IGFer), og granulocytt makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) som fører til dysfunksjon og tap av RPE-celler, etterfulgt av fotoreseptor og retinal ganglion celle (RGC) død3,4 , 4 ,4, . AMD er en kompleks sykdom som skyldes samspillet mellom metabolske, funksjonelle, genetiske og miljømessige faktorer4. Mangelen på behandlinger for aAMD er hovedårsaken til blindhet hos pasienter eldre enn 60 år i industrialiserte land9,10. Rekonstitueringen av det nevrobeskyttende og nevrogene netthinnemiljøet ved subretinal transplantasjon av genetisk modifiserte RPE-celler som overekspresserer PEDF og GM-CSF har potensial til å forhindre retinal degenerasjon ved å redusere effekten av oksidativt stress, hemme betennelse og støtte celleoverlevelse11,12,13,14,15,16 . Selv om det er flere metoder for å levere gener til celler, har vi valgt det ikke-virale hyperaktive Sleeping Beauty transposon-systemet for å levere PEDF- og GM-CSF-genene til RPE-celler på grunn av sikkerhetsprofilen, integreringen av genene i vertscellenes genom, og dets tilbøyelighet til å integrere de leverte genene på ikke-transkripsjonsaktive steder som vi tidligere har vist17, 18,19.

Cellulært oksidativt stress kan induseres i celler dyrket in vitro av flere oksidative midler, inkludert hydrogenperoksid(H2O2), 4-hydroynonenal (HNE), tertbutylhydroperoxide (tBH), høye oksygenspenninger og synlig lys (fullspektret eller UV-bestråling)20,21. Høye oksygenspenninger og lys krever spesialutstyr og forhold, noe som begrenser overførbarheten til andre systemer. Agenter som H2O2, HNE og tBH induserer overlappende oksidativt stressmolekylære og cellulære endringer. Vi valgte H2O2 for å teste antioksidantaktiviteten til PEDF og GM-CSF fordi den er praktisk og biologisk relevant siden den produseres av RPE-celler som et reaktivt oksygen mellomliggende under fotoreseptor ytre segment fagocytose22 og det finnes i okulært vev in vivo23. Siden oksidasjonen av glutathione kan være delvis ansvarlig for produksjonen av H2O2 i øyet, har vi analysert nivåene av GSH / glutathione i våre studier, som er knyttet til H2O2-indusert oksidativt stress og den regenerative kapasiteten til cellene21,22. Analysen av glutathione nivåer er spesielt relevant siden den deltar i antioksidative beskyttelsesmekanismer i øyet24. Eksponering for H2O2 brukes ofte som modell for å undersøke oksidativ stressfølsomhet og antioksidantaktivitet i RPE-celler1,25,26,27,28,29,30, og i tillegg viser den likheter med lysindusert oksidativ stressskade, en “fysiologisk” kilde til oksidativt stress21.

For å evaluere funksjonaliteten og effektiviteten av nevrobeskyttende faktorer har vi utviklet en in vitro-modell som gjør det mulig for analysen å kvantifisere den antioksidative effekten av vekstfaktorer uttrykt av celler genetisk modifisert for å overekspressere PEDF og GM-CSF. Her viser vi at RPE-celler transfektert med genene for PEDF og GM-CSF er mer motstandsdyktige mot de skadelige effektene av H2O2 enn ikke-transfekerte kontrollceller, som det fremgår av cellemorfologi, tetthet, levedyktighet, intracellulært nivå av glutathione og uttrykk for UCP2-gen, som koder for mitokondrie-frakoblingsprotein 2 som har vist seg å redusere reaktive oksygenarter (ROS)31.

Protocol

Prosedyrer for innsamling og bruk av menneskelige øyne ble godkjent av Cantonal Ethical Commission for Research (nr. 2016-01726). 1. Celleisolasjon og kulturforhold Menneskelig ARPE-19-cellelinje Kultur 5 x 105 ARPE-19 celler, en menneskelig RPE celle linje, i Dulbecco’s Modified Eagle medium / næringsblanding F-12 Skin (DMEM / Hams F-12) supplert med 10% fetal bovine serum (FBS), 80 U / ml penicillin, 80 μg/ml streptomycin og 2,5 μg/ml amfotericin B (komplett …

Representative Results

Induksjon av oksidativt stress i humane retinal pigment epitelcellerARPE-19 og primære hRPE-celler ble behandlet med varierende konsentrasjoner av H2O2 i 24 timer og det intracellulære nivået av antioksidantglutseksjonen ble kvantifisert (Figur 2A,B). H2O2 ved 50 μM og 100 μM påvirket ikke glutathioneproduksjonen, mens ved 350 μM var det en signifikant reduksjon av glutat…

Discussion

Protokollen som presenteres her tilbyr en tilnærming for å analysere den antioksidative og beskyttende funksjonen til PEDF og GM-CSF produsert av transfected celler, som kan brukes på celler transfektert med ethvert putativt gunstig gen. I genterapeutiske strategier som har som mål å levere proteiner til vev ved å transplantere genetisk modifiserte celler, er det viktig å skaffe informasjon om nivået av proteinuttrykk, uttrykkslevelighet og effektiviteten av det uttrykte proteinet i en modell av sykdommen. I vår…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil takke Gregg Sealy og Alain Conti for utmerket teknisk assistanse og prof. Zsuzsanna Izsvák fra Max-Delbrück Center i Berlin for vennlig å gi pSB100X og pT2-CAGGS-Venus plasmider. Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Sciences Foundation og EU-kommisjonen i sammenheng med det syvende rammeprogrammet. Z.I ble finansiert av European Research Council, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
  2. Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells. Antioxidants. 6 (4), (2017).
  3. Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. A Review of current and future management of geographic atrophy. Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).
  4. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: a review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  5. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD – From hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  6. Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. Oxidative stress and reactive oxygen species. Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).
  7. Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
  8. Alhasani, R. H., et al. Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress. Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).
  9. . National Institute of Health Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020)
  10. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  11. He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).
  12. Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence. Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).
  13. Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells. Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).
  14. Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. Retinal Degenerative Diseases. , 699-706 (2016).
  15. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death. Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).
  16. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins. Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).
  17. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  18. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  19. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. BioMed Research International. 2015, (2015).
  20. Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells. Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).
  21. Allen, R. G., Tresini, M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).
  22. Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).
  23. Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).
  24. Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor. Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).
  25. Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).
  26. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).
  27. Chen, X. -. D., Su, M. -. Y., Chen, T. -. T., Hong, H. -. Y., Han, A. -. D., Li, W. -. S. Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway. International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).
  28. Tu, G., et al. Allicin attenuates H2O2 – induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species. Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).
  29. Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating. Nutrients. 11, 1-13 (2019).
  30. Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells. Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).
  31. Ma, S., et al. Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress. American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).
  32. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  33. Mátés, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  34. . Marienfeld Technical information Neubauer-improved Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020)
  35. . Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020)
  36. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  37. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  38. Zhuge, C. C., et al. Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).
  39. Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).
  40. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).
  41. Wang, X., et al. PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression. Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).
  42. Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).

Tags

Keywords: Oxidative StressHydrogen PeroxideSleeping Beauty TransposonHuman Retinal Pigment Epithelial CellsAge-related Macular DegenerationNeurodegenerative DiseasesARPE-19 Cell LinePEDFGM-CSFNickel NTAProtein PurificationBCA Protein AssayConditioned MediumHydrogen Peroxide Treatment
check_url/it/61957?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image