Um modelo de murina síndico de endometriose usando ratos naturalmente ciclistas
Summary
Muitos modelos de roedores de endometriose são limitados pela complexidade técnica, reprodutibilidade e/ou necessidade de animais imunocomprometidos ou ratos repórteres especiais. Apresentamos um sistema simplificado de indução de lesão utilizando qualquer camundongo experimental com um sistema de pontuação objetiva e independentemente verificável e sem necessidade de cirurgia de ovariectomia ou sobrevivência.
Abstract
A endometriose é uma das principais causas de dor pélvica e infertilidade. É definido pela presença de tecido endometrial em locais extrauterinos. O desenvolvimento de novas terapias e ferramentas de diagnóstico para endometriose tem sido limitado devido, em parte, aos desafios no estudo da doença. Fora dos primatas, poucos mamíferos menstruam, e nenhum desenvolve endometriose espontânea. Modelos de roedores são populares, mas requerem indução artificial da endometriose, com muitos utilizando camundongos imunocomprometidos ou doenças induzidas cirurgicamente. Recentemente, mais atenção tem sido dada aos modelos que envolvem injeção intraperitoneal. Apresentamos um modelo murino de endometriose que integra várias características dos modelos de endometriose existentes em um novo sistema simplificado que se baseia na quantificação microscópica em vez de classificação subjetiva. Neste modelo, realizamos estimulação hormonal de camundongos doadores, injeção intraperitoneal, levantamento abdominal sistemático e colheita de tecidos, e quantificação histológica que pode ser realizada e verificada a qualquer momento após a necropsia. Este modelo requer recursos mínimos e treinamento; não requer perícia por técnicos de laboratório em cirurgia de sobrevivência de murinas ou na identificação de lesões endometriotes brutas; pode ser usado em camundongos imunocomprometidos, imunocompetente e/ou mutantes; e cria lesões endometriotes que são histologicamente consistentes com a doença endometriotica humana.
Introduction
A endometriose é uma doença enigmática do trato reprodutivo feminino com cargas financeiras e de saúde significativas sobre as mulheres1,2. A etiologia da endometriose não é completamente compreendida, e várias explicações foram propostas, incluindo metaplasia coelomicica, repouso mülleriano embrionário, recrutamento de células progenitoras derivadas da medula óssea e menstruação retrógrada3. Embora vários aspectos desses mecanismos propostos possam estar envolvidos, e nenhuma explicação única possa explicar todas as formas da doença, o modelo principal de patogênese endometriose é a menstruação retrógrada. Menstruação retrógrada é a passagem do efluente menstrual através dos tubos de falópio e para a cavidade peritoneal; estima-se que 90% das mulheres menstruadas passam regularmente por menstruação retrógrada4,5. Dado esse fenômeno comum da menstruação retrógrada, por que a endometriose se desenvolve apenas em um subconjunto de mulheres não está claro5. Para entender melhor a etiologia dessa doença, estudos humanos diretos não são viáveis e estudos em animais são justificados.
A endometriose é um desafio tanto para tratar quanto para estudar. A prevalência da doença não é conhecida, mas estimada em 10%1. Embora alguns tipos avançados de endometriose possam ser identificados com precisão por meio de imagens não invasivas, um diagnóstico definitivo só é obtido através da análise histopatológica de amostras de biópsia obtidas cirurgicamente; lesões que visualmente parecem estar doentes, podem de fato ser fibrose ou cicatrizes de outras causas6. A gravidade e a extensão da doença não se correlacionam com a sintomatologia7.
As lesões de endometriose consistem em tipos de células heterogêneas e populações que interagem de forma complexa dentro do microambiente, limitando, portanto, a utilidade dos modelos celulares8,9. Existem modelos in vivo, mas estes têm desafios e limitações inerentes10,11,12. Modelos de primatas são ideais, mas muitas vezes não são viáveis13,14,15. Poucos mamíferos não primatas menstruam e desenvolvem endometriose espontaneamente16. Existem modelos de endometriose de roedores, mas cada um tem limitações17. Muitos desses modelos requerem cirurgia de sobrevivência para suturar ou implantar tecido endometrial na parede ou intestino receptor do doador, adicionando complexidade técnica, necessidade de anestesia e confundindo fatores imunológicos da própria cirurgia18,19,20. Além disso, muitos modelos requerem ovaectomia e suplementação de estrogênio; ao mesmo tempo em que aumenta o rendimento da lesão, isso adiciona tempo, despesas e cirurgia de sobrevivência adicional. Modelos de injeção intraperitoneal (IP) não requerem anestesia ou cirurgia de sobrevivência, e esses modelos logicamente simulam a menstruação retrógrada melhor do que os modelos de sutura21,22,23. A maioria dos modelos de IP, no entanto, estão sujeitos a maior variabilidade no local da lesão devido à dispersão aleatória de fragmentos endometrial após a injeção e, portanto, a mais viés na identificação e medição da lesão.
Aqui apresentamos um modelo murino de endometriose que integra várias características dos modelos de endometriose existentes em um sistema novo, simplificado e eficiente que se baseia na quantificação microscópica em vez de classificação subjetiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosso estudo demonstra que a endometriose pode ser induzida de forma confiável em camundongos sem exigir o uso de cirurgia de ovariectomia e/ou sobrevivência, e que lesões endometrial ectópicas podem ser identificadas e quantificadas por meio de um levantamento padronizado do abdômen e análise histológica.
Muitos estudos de endometriose de endometriose utilizam endometriose cirurgicamente indu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Reizes por sua revisão crítica e insights durante a preparação do manuscrito, bem como os núcleos de Imagem e Histologia do Lerner Research Institute por sua assistência na coleta de dados e análise de dados. Este trabalho foi apoiado por meio de um financiamento interno através do Comitê do Programa de Pesquisa da Cleveland Clinic e de uma subvenção externa através da Society for Reproductive Investigation e da Bayer. A pesquisa no Laboratório Reizes também é financiada por meio do VeloSano Bike to Cure, Centro de Excelência em Pesquisa em Câncer Ginecológico, e através da Laura J. Fogarty Dotada de Cadeira para Pesquisa uterina do câncer. A Cleveland Clinic possui a permissão de direitos autorais para a Figura 1 e a Figura 2.
Materials
| Supplies for injecting PMSG into donor mouse | |||
| 1 mL Tuberculin syringe with 27G needle | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing | |||
| 6” serrated forceps, curved tip | Electron Microscopy Sciences | 72993-6C | |
| 70% ethanol solution | Pharmco | 33000HPLCCS4L | 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME54TE | |
| Carbon dioxide | TriGas Supplier | ||
| Dissecting tray | Fisher Scientific | S14000 | |
| No. 10 disposable scalpel | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scissors, curved | Electron Microscopy Sciences | 72941 | |
| Scissors, straight | Electron Microscopy Sciences | 72940 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | Leica SE 4 | For tissue dissection |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | Institutional core facility supplies | ||
| Surgical instrument sterilization tray | Electron Microscopy Sciences | 66112-02 | |
| Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Weighing dishes | Fisher Scientific | 02-202-103 | |
| Supplies for injecting into recipient mouse | |||
| 1 cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 18 G needle | Fisher Scientific | 148265d | |
| 200 uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-422 | |
| Double distilled water | Institutional core facility supplies | ||
| Latex bulb | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Micro cover glass slip | VWR | 48366-067 | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DM IL | For evaluating vaginal cytology smears |
| Supplies for harvesting tissue from recipient mouse | |||
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| Precision Digital Calipers | Electron Microscopy Sciences | 62065-40 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 22-272416 |
Riferimenti
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