En Syngeneic Murine Model af endometriose ved hjælp af naturligt cykling Mus
Summary
Mange gnavermodeller af endometriose er begrænset af teknisk kompleksitet, reproducerbarhed og/eller behov for immunkompromitterede dyr eller specielle reportermus. Vi præsenterer et forenklet system af læsionsinduktion ved hjælp af enhver eksperimentel mus med et uafhængigt verificerbart, objektivt scoringssystem og uden krav om ovariektomi eller overlevelseskirurgi.
Abstract
Endometriose er en førende årsag til bækkensmerter og infertilitet. Det er defineret ved tilstedeværelsen af endometrievæv på ekstrauterin steder. Udviklingen af nye behandlingsformer og diagnostiske værktøjer til endometriose har været begrænset på grund af udfordringer i forbindelse med undersøgelsen af sygdommen. Uden for primater, få pattedyr menstruation, og ingen udvikler spontan endometriose. Gnavermodeller er populære, men kræver kunstig induktion af endometriose, hvor mange bruger enten immunkompromitterede mus eller kirurgisk induceret sygdom. For nylig er der blevet lagt mere vægt på modeller, der involverer intraperitoneal injektion. Vi præsenterer en murin model af endometriose, der integrerer flere funktioner i eksisterende endometriose modeller i et nyt, forenklet system, der er afhængig af mikroskopiske kvantificering i stedet for subjektive klassificering. I denne model udfører vi hormonel stimulation af donormus, intraperitoneal injektion, systematisk abdominal undersøgelse og vævshøst og histologiske kvantificering, der kan udføres og verificeres når som helst efter obduktion. Denne model kræver minimale ressourcer og uddannelse; ikke kræver ekspertise fra laboratorieteknikere i forbindelse med overlevelseskirurgi af murin eller identifikation af grove endometriotiske læsioner kan anvendes i immunkompromitterede, immunkompetente og/eller mutantmus og pålideligt skaber endometriotiske læsioner, der er histologisk i overensstemmelse med menneskets endometriotiske sygdom.
Introduction
Endometriose er en gådefuld sygdom i den kvindelige reproduktive tarmkanal med betydelige økonomiske og sundhedsmæssige byrder på kvinder1,2. Endometrioseens ætiologi er ikke helt forstået, og der er foreslået flere forklaringer, herunder coelomisk metaplasi, embryonale Müllerian hviler, rekruttering af knoglemarvsafledte stamceller og retrograd menstruation3. Mens flere aspekter af disse foreslåede mekanismer kan være involveret, og ingen enkelt forklaring kan tegne sig for alle former for sygdommen, den førende model for endometriose patogenese er retrograd menstruation. Retrograd menstruation er passagen af menstruationsspildevand gennem æggelederne og ind i peritonealhulen; det anslås, at 90% af menstruationskvinder regelmæssigt gennemgår retrograd menstruation4,5. I betragtning af dette almindelige fænomen med retrograd menstruation, hvorfor endometriose kun udvikler sig i en delmængde af kvinder er uklart5. For bedre at forstå ætiologien af denne sygdom er direkte humane undersøgelser ikke mulige, og dyreforsøg er berettigede.
Endometriose er en udfordring både at behandle og studere. Prævalensen af sygdommen kendes ikke, men skønnes at være 10%1. Mens nogle avancerede typer af endometriose kan identificeres nøjagtigt gennem ikke-invasiv billeddannelse, opnås en endelig diagnose kun gennem histopatologiske analyser af kirurgisk opnåede biopsiprøver; læsioner, der visuelt ser ud til at være syge, kan faktisk være fibrose eller ardannelse fra andre årsager6. Sværhedsgraden og omfanget af sygdommen korrelerer ikke med symptomatologi7.
Endometrioselæsioner består af heterogene celletyper og populationer, der interagerer på komplekse måder inden for mikromiljøet, hvilket begrænser nytten af cellulære modeller8,9. In vivo-modeller findes, men disse har iboende udfordringer og begrænsninger10,11,12. Primatmodeller er ideelle , men er ofte ikke gennemførlige13,14,15. Få ikke-primat pattedyr menstruere og udvikle endometriose spontant16. Gnavermodeller af endometriose findes, men hver har begrænsninger17. Mange af disse modeller kræver overlevelse kirurgi for at sutur eller implantat endometrie væv i donor modtageren væg eller tarm, tilføjer teknisk kompleksitet, behov for anæstesi, og forvirrende immunfaktorer fra selve operationen18,19,20. Derudover kræver mange modeller ovariektomi og østrogentilskud; mens øge læsion udbytte, dette tilføjer tid, omkostninger, og yderligere overlevelse kirurgi. Intraperitoneal (IP) injektionsmodeller kræver ikke anæstesi eller overlevelseskirurgi, og disse modeller simulerer logisk retrograd menstruation bedre end at suturere modeller21,22,23. De fleste IP-modeller er imidlertid udsat for større variation i læsionsplaceringen på grund af den tilfældige spredning af endometriefragmenter efter injektionen og derfor mere bias i læsionsidentifikation og -måling.
Her præsenterer vi en murine model af endometriose, der integrerer flere funktioner i eksisterende endometriose modeller i en ny, forenklet og effektivt system, der er afhængig af mikroskopiske kvantificering i stedet for subjektive klassificering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vores undersøgelse viser, at endometriose kan fremkaldes pålideligt hos mus uden brug af ovariectomy og / eller overlevelse kirurgi, og at ektopiske endometrie læsioner kan identificeres og kvantificeres ved hjælp af en standardiseret undersøgelse af maven og histologiske analyse.
Mange murin undersøgelser af endometriose udnytte kirurgisk induceret endometriose, hvor donor endometrium er syet …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke medlemmerne af Reizes-laboratoriet for deres kritiske gennemgang og indsigt under forberedelsen af manuskriptet samt Imaging- og Histology-kernerne på Lerner Research Institute for deres hjælp til dataindsamling og dataanalyse. Dette arbejde blev støttet gennem en intern tilskud finansiering gennem Research Program Udvalg på Cleveland Clinic og af et eksternt tilskud gennem Society for Reproduktiv Undersøgelse og Bayer. Forskning i Reizes Laboratory er også finansieret gennem VeloSano Bike to Cure, Center of Research Excellence i gynækologisk kræft, og gennem Laura J. Fogarty Begavet Chair for Uterine Cancer Research. Cleveland Clinic ejer tilladelsen til ophavsret til figur 1 og figur 2.
Materials
| Supplies for injecting PMSG into donor mouse | |||
| 1 mL Tuberculin syringe with 27G needle | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing | |||
| 6” serrated forceps, curved tip | Electron Microscopy Sciences | 72993-6C | |
| 70% ethanol solution | Pharmco | 33000HPLCCS4L | 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME54TE | |
| Carbon dioxide | TriGas Supplier | ||
| Dissecting tray | Fisher Scientific | S14000 | |
| No. 10 disposable scalpel | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scissors, curved | Electron Microscopy Sciences | 72941 | |
| Scissors, straight | Electron Microscopy Sciences | 72940 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | Leica SE 4 | For tissue dissection |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | Institutional core facility supplies | ||
| Surgical instrument sterilization tray | Electron Microscopy Sciences | 66112-02 | |
| Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Weighing dishes | Fisher Scientific | 02-202-103 | |
| Supplies for injecting into recipient mouse | |||
| 1 cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 18 G needle | Fisher Scientific | 148265d | |
| 200 uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-422 | |
| Double distilled water | Institutional core facility supplies | ||
| Latex bulb | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Micro cover glass slip | VWR | 48366-067 | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DM IL | For evaluating vaginal cytology smears |
| Supplies for harvesting tissue from recipient mouse | |||
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| Precision Digital Calipers | Electron Microscopy Sciences | 62065-40 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 22-272416 |
Riferimenti
- Zondervan, K. T., Becker, C. M., Missmer, S. A. Endometriosis. England Journal of Medicine. 382 (13), 1244-1256 (2020).
- Schwartz, K., Llarena, N. C., Rehmer, J. M., Richards, E. G., Falcone, T. The role of pharmacotherapy in the treatment of endometriosis across the lifespan. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 21 (8), 893-903 (2020).
- Giudice, L. C. Clinical practice. Endometriosis. New England Journal of Medicine. 362 (25), 2389-2398 (2010).
- D’Hooghe, T. M., Debrock, S. Endometriosis, retrograde menstruation and peritoneal inflammation in women and in baboons. Human Reproduction Update. 8 (1), 84-88 (2002).
- Ahn, S. H., et al. Pathophysiology and immune dysfunction in endometriosis. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Falcone, T., Flyckt, R. Clinical management of endometriosis. Obstetrics and Gynecology. 131 (3), 557-571 (2018).
- Vercellini, P., et al. Association between endometriosis stage, lesion type, patient characteristics and severity of pelvic pain symptoms: a multivariate analysis of over 1000 patients. Human Reproduction. 22 (1), 266-271 (2007).
- Bulun, S. E., et al. Endometriosis. Endocrine Reviews. 40 (4), 1048-1079 (2019).
- Brueggmann, D., et al. Novel three-dimensional in vitro models of ovarian endometriosis. Journal of Ovarian Research. 7, 17 (2014).
- Dodds, K. N., Beckett, E. A. H., Evans, S. F., Hutchinson, M. R. Lesion development is modulated by the natural estrous cycle and mouse strain in a minimally invasive model of endometriosis. Biology of Reproduction. 97 (6), 810-821 (2017).
- Martinez, J., Bisbal, V., Marin, N., Cano, A., Gómez, R. Noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), (2019).
- Pelch, K. E., Sharpe-Timms, K. L., Nagel, S. C. Mouse model of surgically-induced endometriosis by auto-transplantation of uterine tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3396 (2012).
- Nishimoto-Kakiuchi, A., et al. Spontaneous endometriosis in cynomolgus monkeys as a clinically relevant experimental model. Human Reproduction. 33 (7), 1228-1236 (2018).
- Nair, H. B., et al. An efficient model of human endometriosis by induced unopposed estrogenicity in baboons. Oncotarget. 7 (10), 10857-10869 (2016).
- Laganà, A. S., et al. Translational animal models for endometriosis research: a long and windy road. Annals of Translational Medicine. 6 (22), 431 (2018).
- Bellofiore, N., et al. First evidence of a menstruating rodent: the spiny mouse (Acomys cahirinus). Amercian Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (1), 1-11 (2017).
- Bruner-Tran, K. L., Mokshagundam, S., Herington, J. L., Ding, T., Osteen, K. G. Rodent models of experimental endometriosis: identifying mechanisms of disease and therapeutic targets. Current Women’s Health Reviews. 14 (2), 173-188 (2018).
- Bilotas, M. A., et al. Interplay between endometriosis and pregnancy in a mouse model. PloS One. 10 (4), 0124900 (2015).
- Peterse, D., et al. Of mice and women: a laparoscopic mouse model for endometriosis. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 25 (4), 578-579 (2018).
- Richards, E. G., et al. KLF11 is an epigenetic mediator of DRD2/dopaminergic signaling in endometriosis. Reproductive Sciences. 224 (8), 1129-1138 (2017).
- Jones, R. L., Lang, S. A., Kendziorski, J. A., Greene, A. D., Burns, K. A. Use of a Mouse Model of Experimentally Induced Endometriosis to Evaluate and Compare the Effects of Bisphenol A and Bisphenol AF Exposure. Environmental Health Perspectives. 126 (12), 127004 (2018).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Nothnick, W. B., Graham, A., Holbert, J., Weiss, M. J. miR-451 deficiency is associated with altered endometrial fibrinogen alpha chain expression and reduced endometriotic implant establishment in an experimental mouse model. PloS One. 9 (6), 100336 (2014).
